基于原位生物测试的水生态风险评估技术研究

裴媛媛， 佟宇俊， 李慧珍， 符志友， 张 远， 游 静*

1.暨南大学环境学院， 广东省环境污染与健康重点实验室， 广东 广州 510443

2.中国环境科学研究院， 环境基准与风险评估国家重点实验室， 北京 100012

随着工业化和城镇化进程的加快，来自工业生产、农业活动和居民生活的各类污染物被排入环境中，最终在受纳水体和沉积物中呈现典型的复合污染状况，直接威胁水生态健康. 目前，水环境生态风险评估方法一般包括商值法、生物测试和野外生态调查三大类[1]：商值法通过获取环境介质中污染物浓度，然后将其与基准值比较判断风险；生物测试一般在实验室中进行，将模式生物暴露在野外采集的水或沉积物样品中获取毒性效应结果；野外生态调查主要针对本土鱼类和大型底栖无脊椎动物的种群丰度等进行观测统计，直接反映生态系统的受损状况. 三类方法(单独或联合)已被广泛应用在水生态风险评估，但也各自存在一定的局限性. 商值法中基准值的推导过程假定污染物为单一暴露，忽略了复合污染下污染物之间的交互作用[2]，而且传统分析方法缺少考虑污染物的生物有效性，使得评估结果存在偏差. 实验室生物测试一方面在样品采集过程中因人为操作可能会改变污染物形态[3]，而且瞬时采样难以代表真实环境中污染物浓度随时间的波动[4]；另一方面，实验室中恒定的温度、pH、溶解氧和光照等条件，难以真实模拟野外实际暴露情况[5-6]，这些都会造成风险评估结果的偏差[7]. 野外生态调查针对本土物种，难以确定种别和生长阶段，而且生物在长期污染压力下可能产生适应性，对污染物的敏感度改变，影响风险判断[8]. 野外原位生物测试则可以有效降低上述问题对风险评估结果的影响，还能成为实验室生物测试和野外生态调查的桥梁[9]，有助于实验室个体水平的毒性结果向野外种群层面的外推. 因此，发展原位生物测试方法，获取受试生物在复合污染胁迫下的真实毒性效应和体内积累浓度信息，对准确评估水生态风险具有重要意义.

原位生物测试是指将受试生物暴露于野外真实环境中，测定污染物在个体水平上的生物积累及毒性效应[10]，其操作方式包括将生物放置于暴露室、移植到环境介质、圈围研究位点、搭建近岸微宇宙和在线自动化生物测试[11]，其中将生物放置于暴露室来进行原位测试的应用研究最多，其具有设计灵活、操作简便的优势. 原位生物测试在20世纪80年代初首次使用[3]，经过近40年的发展，受试生物从鱼类和双壳贝类逐渐拓展到多种大型无脊椎动物，从单一物种暴露发展为多物种同时暴露，而研究位点也涵盖了淡水、海洋、河口和湿地等. 美国试验材料学会(American Society for Testing Material，ASTM)在2001年编订了《双壳贝类进行原位生物测试的标准方法》，并分别在2002年、2007年和2013年进行了修订[12]，也为其他生物的原位暴露试验提供了参考. 2004年环境毒理与化学协会(Society of Environmental Toxicology and Chemistry，SETAC)召开围绕原位生物测试的主题研讨会并发表系列文章[8-9,11,13]，从方法论和应用性等方面进行系统阐述，此后，原位生物测试在水生态风险评估中的应用得以显著促进. 近年来，在北美和欧洲等国家进行原位生物测试的研究应用越来越多，形成了逐步标准化的暴露装置和操作流程[10]，研究范围也发展为整个流域和国家[14]，相对而言，中国在该方面的研究仍较为匮乏.

为了促进我国水环境生态风险评估中原位生物测试方法的应用，该研究通过介绍原位生物测试方法的实施三要素，即受试生物、暴露装置和研究位点，重点阐述其选择或设计原则，并举例加以说明，为方法的具体实施提供指导，在此基础上总结了原位生物测试方法在水生态风险评估中三类常见的应用场景，包括基于原位生物效应的评估，基于生物体内浓度的评估，以及与环境浓度相结合的风险评估，通过案例分析来梳理如何利用原位生物测试结果进行风险评估，最后讨论了该方法的发展和应用前景，以期为我国水环境风险评估提供新思路.

1 原位生物测试方法的介绍

1.1 受试生物

选择合适的受试生物对原位生物测试至关重要，受试生物可以是实验室养殖的模式生物，也可以是经过驯化的本土生物[15]. 模式生物的优势在于，一方面其具有丰富的生物学信息和毒性数据，而且生活史明确，同批次生物具有相同的生物学特征(大小、生长阶段、性别等)；但另一方面需要考虑的是，所选物种需要在所研究的生态系统中具有代表性. 本土生物可以选择研究区域的关键物种、指示物种或优势物种，其相关的生物学和毒理学研究较为充分，较容易实现实验室的驯养，驯养过程还需要根据该种生物的行为和摄食习惯等来判断其是否适于放置在暴露室[13]. 因污染场地可能显著改变本土生物的耐受性，所以需要采集自干净区域的本土生物，并尽量使用相同生物学特征的受试生物.

考虑到具体实施过程对受试生物的影响，在选择受试物种时还需要考虑生物对水质参数的耐受范围、个体大小和运输耐受性[10]. 生物对温度、pH、电导率和溶解氧的耐受范围广，可以避免原位暴露时水质参数波动引起的个体死亡. 个体大小适中，既有利于暴露室的设计和投放，也能为测定生物体内污染物浓度和毒性终点提供充足的样品量. 个体小的受试生物活动范围也小，对应小体积的暴露室，可以在保证生物放养密度和运输要求下，增加每个位点暴露室的平行样，从而增加统计可信度. 此外，从实验室到野外位点的运输过程不可避免会对生物产生一定影响，太过敏感的生物容易在颠簸中造成机体损伤，干扰后续的原位测试结果.

目前原位生物测试研究中的受试生物有鱼类(见表1)以及双壳类、腹足类、甲壳类、多毛纲、寡毛纲等无脊椎动物(见表2). 常见的鱼类包括模式生物黑头软口鲦[16-20]和虹鳟鱼[26]，以及本土物种鲫鱼[22-23]、罗非鱼[24-25]和鲑鱼[26]等，常见的双壳类包括菲律宾蛤仔[29-30]、河蚬[30-31]和贻贝[32-35]，腹足类有铜锈环棱螺[36]和泥螺[37]，甲壳类有模式生物钩虾[14,38-39]、大型溞[39]和模糊网纹溞[1]，其他用于生物暴露的底栖无脊椎动物还有模式生物摇蚊幼虫[39-42]、沙蚕[5,10]、水螅和蜉蝣幼虫[1]. 研究位点的环境介质可以细分为上层水体、底层水体、水-沉积物界面、表层沉积物、沉积物空隙水，目标环境介质一般和生物的栖息地相匹配，鱼类和甲壳类暴露在水体，底栖无脊椎动物暴露在沉积物中，而双壳贝类由于既可以摄食沉积物颗粒还可以滤食水体中的浮游藻类和有机碎屑，在水体[30,32-33,35]和沉积物[29,31,33-34]中的应用均较多.

受试生物的原位暴露时间往往结合效应终点来确定，时长范围从2 d的短期暴露到两个月的长期暴露(见表1、2). 敏感效应终点一般对应短期暴露，生长、繁殖和体内浓度的效应终点对应长期暴露，也有研究将处于较早生命周期的受试生物进行短期原位暴露，之后将其收集后继续在实验室长期喂养，以探究早期原位复合污染暴露对生物发育、摄食率和繁殖率的影响[10,43].

受试生物的效应终点往往根据研究目标和生物特征来选择，涵盖从基因水平到个体水平(见表1、2)，基因水平的效应终点有与内分泌[17]、细胞色素、金属硫蛋白和卵黄蛋白原[26]相关的基因表达，以及卵巢转录组[16]、DNA损伤[27,29-31]等；分子水平的效应终点有葡萄糖含量[20,25]、蛋白质羰基含量[24,36]、代谢相关酶和抗氧化酶活性[22-25,27,30-31,36,44]、线粒体电子转移[29]等；器官组织水平的效应终点有组织病理[24,27,31]、肝体指数[22,28]、各组织器官污染物浓度[22]等；个体水平的效应终点有存活率[1,5,10,19,21,35,37,39-41]、摄食率[1,5,10,38,43]、生长速率[19,41-42]、发育[10]、繁殖[19,37]等.

受试生物的物种、暴露时间和效应终点是进行原位生物测试的基础，其选择的合理性直接影响生态风险评估结果. 与实验室生物测试通常采用模式生物相比，原位生物测试往往更灵活地选用本土生物，使其更具生态相关性，能够更准确地表征研究位点复合污染对本土生物的胁迫，但使用不同种类的本土生物也造成原位暴露方法难以严格标准化. 为了促进原位生物测试在环境风险评估和管理中的应用，优先推荐模式生物，利用国内外已有的剂量-效应数据，更好地阐释暴露和原位效应的因果关系.

1.2 暴露装置

原位生物测试的暴露装置是保证测试结果有效的关键要素，设计的基本要求是将受试生物限制在研究位点，同时生物又可与目标环境介质充分接触，尽量减小装置内暴露条件与外界的差异，使受试生物尽可能暴露在自然真实的环境中[13]. 在此要求下，暴露装置所用材质要求无毒无害、物理化学性质稳定，可以耐受目标区域水质参数的波动，常见的材料为尼龙[26,32,36-37]、聚乙烯[1,22,27,34-35]、聚氯乙烯[29]、醋酸丁酸纤维素[1,39]和亚克力[43]等塑料和不锈钢[19-20,33](见表1、2). 若装置为圆筒形状，考虑到透光性需要使用透明的塑料材质[1,39]. 使用塑料材质时，需要注意装置可能对疏水性有机污染物有一定的吸附作用，这需要在实验室预先评估，装置对污染物的吸附是否会对原位测试产生影响[1].

装置一般通过网孔与外界环境介质联通，而装置网孔大小的设计需要从多方面考虑. 对于受试生物来说，由于活动范围被限制在暴露装置内，溶解氧和营养物质的获取以及代谢废物的排出需要依赖暴露装置内外的水流交换. 如果网孔较小会造成暴露室内溶解氧降低、氨氮升高[10]，对受试生物产生较大的胁迫，而且小网孔更容易造成藻类等生物淤积产生堵塞；如果网孔过大，可能造成生物逃逸、增加本地捕食者入侵的可能性.

表1 鱼类原位生物测试的应用

装置大小的设计，一方面兼顾运输和投放回收时的便捷性，减少对环境的扰动；另一方面要保证合理的生物密度，不对受试生物造成压力或造成非自然的空间、资源竞争[13]. 对于开展长期暴露但无法获取足够营养物质的受试生物，还需要加装食物投喂装置[19,42]，避免因营养不足对生物产生压力，造成不良效应.

表2 无脊椎动物原位生物测试的应用

续表2

注： 装置A为适合鱼类暴露的网框状装置；装置B为适合双壳贝类的网袋装置；装置C为适合底栖无脊椎动物的圆筒装置.

目前，研究中常用的暴露装置依据受试生物的不同可分为3种类型，3种装置示意如图1所示. 由图1可见：装置A为适合鱼类暴露的网框状装置[16,19-28]，下端系有砖石固定，上端系有浮球，通过调整浮球和网框的距离来决定受试生物在水体的暴露深度，网框形状一般为圆柱体和立方体；装置B为适合双壳贝类的网袋装置[30,32,34]，也是《双壳贝类进行原位生物测试的标准方法》中推荐使用的，将贝类放入网袋，竖直排列，每个贝之间用束带隔开，每串竖直挂在方形框架上以保证水流的充分交换，该装置操作简单，可以同时进行大量贝类的原位测试；装置C为适合底栖无脊椎动物的圆筒装置[1,14,39,43]，透明的塑料圆筒两端封上盖子，侧边开窗覆尼龙网进行水流交换. 如果受试生物为钩虾和大型溞等栖息在沉积物表面的，圆筒直接放置在沉积物上；如果受试生物为带丝蚓和摇蚊幼虫等栖息在表层沉积物中的底栖动物，圆筒需要插入沉积物，使沉积物通过网窗进入暴露室，保证受试生物与沉积物直接接触.

在上述三类暴露装置的基础上，研究者们加入了自动取样器[4]、在线水质传感器和被动采样器[10,37]，可以同步获取环境水质信息和污染物环境浓度，并实现了多物种同时暴露[5]，获取更全面的效应信息. 其中以Burton等[10]设计的沉积物生态毒性评估环〔Sediment Ecotoxicity Assessment (SEA) Ring〕最具代表性，其集多暴露室、水质监测和被动采样于一体，同步进行沉积物上覆水(底层水体)、水-沉积物界面和表层沉积物的生物测试，实时监测暴露室内的温度、溶解氧、pH、电导率、盐度和氧化还原电位；同时利用被动采样器获取有机污染物和重金属的生物有效浓度，为评估沉积物的生态风险提供较全面的原位暴露和效应证据.

暴露装置是原位生物测试区别于实验室生物测试的特色所在，但需要将受试生物从实验室转移到野外暴露室，操作更为复杂，因此在设计和实施中应尽可能减少对受试生物的影响，从而提高测试结果的可靠性. 在保证测试效果的前提下，设计简单、操作方便和成本适中的暴露装置具有更大的应用前景，有助于原位生物测试方法的推广. 布设底栖生物的暴露室需要将装置压入沉积物，若水体较深，一般需要潜水员操作，但会增加应用难度和成本，因此建议使用传送杆压入的方式，方便操作者在船上布设暴露装置. 目前，研究中使用的暴露装置向多物种、多环境介质和结合被动采样的方向发展，旨在通过一次野外暴露同时获取尽可能多的关于污染物浓度水平和受试生物毒性效应的数据.

1.3 研究位点

为了保证试验的顺利开展和数据有效性，在进行原位生物测试前，需要先获取研究位点的水文信息、水质参数和栖息地条件[13]. 水文信息包括水深、流速等，决定了生物的原位暴露深度和装置的设计；水质参数包括温度、溶解氧、pH、电导率和氨氮等，需要与受试生物的耐受范围进行比对，若超出耐受范围造成受试生物全部致死，则在该位点进行的生物测试便失去意义；栖息地条件主要指沉积物的情况，特别对需要在沉积物中筑巢的底栖生物会产生较大影响.

研究位点的水温和实验室的喂养水温往往存在差异，为了避免温度差异造成的应激压力，受试生物在投放前需要慢慢调整至研究位点的水温，确保生物适应测试温度[45]. 在投放时暴露装置会对水体和沉积物造成扰动，为了减少影响，有的研究中会留出装置平衡时间，待平衡后再利用生物传送设备将受试生物放置于暴露室[42,46].

由于原位生物测试在实施过程中涉及大量人为操作步骤，如运输、投放、喂食和回收，这些人为影响都可能对结果产生干扰[10]. 为了进行质量保证和质量控制，需要设置实验室控制组和野外参照位点，要求受试生物存活率在80%以上[1]. 实验室对照组的生物需要运至野外现场，但不投放到水环境中，之后再运回实验室进行相同时间的喂养，用来排除运输过程对生物的影响. 野外参照位点一般选择与研究位点水文和栖息地条件比较接近的洁净区域，如河流上游或较少受到人类活动影响的湖泊或海湾位点，用来排除运输、投放过程和野外其他环境因素的干扰.

2 原位生物测试方法在水环境生态风险评估中的应用

2.1 基于原位生物效应的评估

将原位生物效应结果应用在水环境风险评估中，可以直接获取混合污染物对生物体的不良效应，提升评估环境的真实性和准确度. Burton等[1]尝试将黑头软口鲦、大型溞、模糊网纹溞、钩虾、摇蚊幼虫、夹杂带丝蚓、水螅和蜉蝣幼虫用于美国河流和小溪的原位生物测试，根据生物栖息地对应的水体或沉积物暴露，使用包括存活率、摄食率和生长等效应终点来判断复合环境压力对水生生物的风险；同时发现，在大部分研究位点，原位与实验室的效应结果存在明显不同，主要是暴露动力学的差异和样品处理过程的人为偏差造成的.

随着测定技术的发展，受试生物在分子和基因水平上的效应终点可以更灵敏地表征环境中各类痕量污染物共同暴露引起的损伤. 对比参照位点，暴露于污水处理厂受纳海湾沉积物中14 d的菲律宾蛤仔[29]虽然没有死亡，但重金属、多环芳烃、药物和表面活性剂等多种类污染物导致分子水平上生物标志物的显著改变，包括Ⅰ相代谢酶7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)，Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽硫转移酶(GST)，抗氧化系统的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和还原性谷胱甘肽(GR)，表征神经毒性的乙酰胆碱酯酶(AChE)，表征氧化压力的溶酶体膜稳定性(LMS)、脂质过氧化(LPO)和DNA损伤，以及表征个体能量状态的总脂肪含量和线粒体电子转移，这些原位生物效应表明污水排放对海洋沉积物中的底栖生物造成了风险. 在基因水平上，污水处理厂排水导致黑头软口鲦肝脏代谢组学图谱产生差异[18]，农田径流的季节性间歇农药暴露会显著影响黑头软口鲦体内与内分泌相关基因的表达[17]，说明水体中这些外源污染物对鱼类造成了代谢和生长发育的负面影响.

原位生物效应可以直接表征复合污染对水生生物的危害，根据与参考位点的对比来判断是否存在风险，根据不同位点间效应的差异来判别风险高低. 从近期的研究来看，原位生物效应的测试呈多层次、多元化的发展趋势，除了传统的致死、生长发育和摄食率的测定[1,5]，分子和基因水平的效应测定也较为成熟并得到大量应用[27,29-30]；同时出现了代谢组学[18]和转录组学[16]等新技术，其可以识别出各类污染物在低剂量共同暴露下引起的不良生物效应. 针对我国水环境污染区域差异大的现状，同一区域既有部分可引起短期急性毒性的位点，也有主要是痕量污染物引起长期慢性毒性的位点，因此更适合采用多层次毒性终点的原位生物效应来表征不同区域的生态风险.

2.2 基于原位生物体内浓度的评估

原位受试生物的体内污染物积累是对环境中污染物生物可利用性的直接度量，也与生物的毒性效应直接相关，是水生态风险评估中的有力证据. 法国研究团队[14,47-48]利用钩虾作为原位受试生物，通过分析7 d原位暴露后污染物在钩虾体内的浓度，表征河流中污染物的生物有效性. 首先选取了代表不同物理化学特征和人类活动影响程度的27个位点进行初步筛查，控制性别、体重和食物供给条件以保证原位结果的准确性和可对比性，定量分析了钩虾体内11种重金属和38种疏水性有机污染物的浓度(多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯醚和有机氯农药)[48]；然后利用统计方法和模型建立了基于钩虾体内浓度的生物可利用污染阈值，高于该阈值的位点意味着存在污染；随后将该方法在流域尺度上的94个位点推广应用，发现随着钩虾体内重金属Cd、Ni和Pb浓度的升高，本土钩虾种群丰度显著下降，据此推算出基于钩虾体内浓度的生物可利用生态评估浓度[47]. 近期研究[14]覆盖了法国的218个位点，通过原位钩虾体内18种重金属和43种持久性有机污染物浓度进行了更大空间尺度的污染筛查，并与前期建立的污染阈值对比，构建了综合生物可利用污染指数(IBC)，用以定量不同位点的污染风险，发现IBC值的增高会造成大型底栖无脊椎动物种群的退化. 已有研究[14]的开展有效联系了原位生物测试中个体水平效应与野外种群水平效应，进一步提升了原位生物测试在环境管理中应用的前景.

原位暴露生物体内浓度越高说明研究位点的目标污染物在生物体富集的风险越大，更容易进入水生生物食物链进行传递. 在进行风险评估时，如上述对钩虾的研究[14,47-48]，加入体内浓度阈值可以将风险进行定量化判断，但需要大范围研究位点的数据支撑. 因此，布设在小范围研究位点获取的原位生物测试结果往往难以推算出阈值，一般通过与环境浓度相结合来计算生物富集因子(Bioconcentration Factor，BCF)和生物沉积物积累因子(Biota-Sediment Accumulation Factor，BSAF)，从而来表征污染物的生物积累潜力.

2.3 结合环境浓度的评估

将原位生物效应和体内浓度与环境浓度相结合，可以更清楚地探明污染物暴露与效应之间的关系，识别水环境生态风险来源. Perkins等[16]将黑头软口鲦原位暴露于污水处理厂下游河流8 d，并通过暴露装置上的自动取样器连续收集水样，定量检出水体中固醇类、阻燃剂、药物、烷基酚、个人护理品、增塑剂、杀虫剂等53种污染物，结合卵巢转录组方法和污染物-基因相关性分析，筛查出优控污染物. 为了更加准确地定量环境介质中各类污染物的生物有效性，将被动采样方法与原位生物测试结合[5,10,32,37]. 为了评估城市污水处理厂的生态风险，Zounkova等[37]利用泥螺进行了56 d的长期原位生物测试，并同时进行原位被动采样，利用极性有机物整合采样器(Polar Organic Chemical Integrative Sampler, POCIS)和半渗透膜装置(Semipermeable Membrane Device, SPMD)定量多种有机污染物，包括多环芳烃、多氯联苯、有机氯农药、多溴联苯醚、极性农药、药物、全氟有机化合物和烷基酚，结果发现在复合污染胁迫下泥螺的存活率和繁殖均受到显著抑制，而沉积物中的重金属是引起生物致死的主要污染物.

环境浓度作为外暴露水平，体内浓度作为内暴露水平，通过对内外暴露水平和生物效应进行多证据链的分析可以实现更加全面、准确的水生态风险评估. 将原位生物暴露装置和被动采样器进行有机结合，可同步获取原位污染物内外暴露水平和生物效应信息，这也是未来原位生物测试方法的发展趋势.

3 结论与展望

a) 针对我国目前流域水环境的污染现状，原位生物测试能够提供在真实复合污染胁迫下的毒性效应和污染物生物积累信息，有助于实现更有针对性和环境相关性的生态风险评估. 该方法近年来在国际上已得到广泛的应用，在废水排放生态风险评估和污染场地修复评估中的应用案例较多，也应用于大范围的区域筛查和流域评估项目. 相对于传统实验室生物测试，原位生物测试的优势是可以综合复杂的环境条件对受试生物的影响，但这也增加了解释胁迫因子与生物效应关联的难度. 为了更好地识别引起原位生物效应的污染物，目前有研究者将原位生物测试和污染物分离相结合，开发原位毒性鉴别评价技术(insituToxicity Identification Evaluation，iTIE)[49-50]，在生物暴露室前端串联上吸附剂室，通过泵使水通过吸附剂净化后再进入暴露室，不同吸附剂可以对应除去不同类型有机污染物、重金属和氨氮，通过对比有无吸附剂处理造成的原位生物效应差异，鉴别上层水、沉积物孔隙水和排放废水中引起毒性的化合物种类.

b) 相较于已经标准化的实验室生物测试，原位生物测试方法仍缺少标准化，从而限制了其在环境管理中推广应用. 因此，在未来发展中有必要建立统一、规范化的操作流程，明晰实施过程中受试生物、暴露装置和研究位点的选择或设计原则，提高质量控制和质量保证，有利于原位生物测试成为水生态风险评估的有力支撑.

c) 作为生态风险评估的关键环节，暴露评估和效应评估可以通过原位被动采样和生物测试在线同步实现. 将两种方法进行联用，通过证据权重法汇总暴露和效应结果，对研究位点的污染水平和毒性进行综合分析，在水生态风险评估中有很好的应用前景.