PCR-DGGE法分析酸菜中酵母菌微生物的多样性

赵虎威，燕平梅

(太原师范学院 生物系，太原 030619)

酸菜作为中国传统的一道发酵蔬菜，一直以来都深受人们喜爱。传统酸菜具有浓郁的酸香，既清爽又可口。更重要的是酸菜汁具有清热解暑、增强食欲、健脾、通肠道防便秘、降低血脂和胆固醇等有益身体的功效[1]。酸菜是由酵母菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、醋酸杆菌等发酵生成的[2]，在不同的发酵时期每种微生物所起的作用不同，因此使酸菜具有独特的风味[3]。有研究表明酸菜发酵过程中真菌种类比细菌种类少[4]，德巴利汉逊酵母(Debaryomyceshansenii)是真菌中的优势种[5]。前人对酸菜中细菌的研究较多，但对真菌的研究较少，因此本实验选择对真菌中的酵母菌进行研究。

随着分子生物学快速发展，人们更多地从分子和基因水平研究酵母菌的遗传组成和分类。26S rDNA在细胞内有很大的拷贝数，使扩增更容易，能用于近亲缘关系菌株的分类，目前这一区域的应用较广泛[6,7]。一些研究表明分子生物学PCR-DGGE可用于研究酸菜中的酵母菌[8,9]。付琳琳采用PCR-DGGE方法研究泡菜中微生物时发现泡菜中不仅存在乳酸菌，还有其他微生物。

因此本实验采用非培养方法，利用PCR-DGGE技术对酸菜中酵母菌的多样性进行研究[10]。通过一系列方法对酸菜中酵母菌的丰富度、多样性、均匀性进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料与器材

广乐牌泡酸菜(青菜、水、食用盐、调味料酒、香辛料、食品添加剂) 500 g(用SA标记)；松源牌酸菜(白菜、水、料酒、食盐、葱、姜、八角、桂皮、花椒、辣椒、香叶、小茴香) 500 g(用SB标记)；青菜酸菜(青菜、水、食用盐、生姜片)500 g(用SC标记)；白菜酸菜(白菜、水、葱、八角、姜片、盐、味精)500 g(用SD标记)。

TC-96/G/H(b)B型PCR仪；DYY-6C型电泳仪；凝胶成像系统(DcodeTM)、The DcodeTMUniversal Mutation Detection System 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸菜汁中酵母菌DNA的提取

分别取4种泡菜汁18 mL在超净工作台上经无菌滤纸过滤装入9个2 mL离心管中，8000 r/min离心5 min。离心后弃去上清液，将所得沉淀用移液枪收集到一个离心管中，再次离心，弃去上清，小心吸干多余的上清液。用天根生化科技有限公司的离心柱型试剂盒提DNA，在4 ℃保存。配制琼脂糖TAE比值为1%的胶，检测DNA。

1.2.2 26S rDNA的PCR扩增

引物：NL1-GC (cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)；LS 2 (att ccc aaa caa ctc gac tc)。

反应体系：NL 1-GC 1 μL,LS 2 1 μL,DNA 1.5 μL, PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9 μL。

各取PCR产物3.5 μL，按照1.2.1的方法进行琼脂糖凝胶电泳分析。由Marker可知DNA片段长度。

1.2.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

变性梯度凝胶的配方见表1。

表1 变性梯度凝胶的配方

DGGE电泳后凝胶于Bio-Rad公司的凝胶成像系统分析、拍照。将每条可看到的电泳带切割回收，溶胶后作为模板通过PCR反应扩增26S rDNA片段，纯化后与pGM-T Vector进行连接，转化感受态细胞。将检测阳性克隆的送到华大基因公司进行基因序列测定。

1.2.4 DGGE图谱分析

用Quantity One分析凝胶成像仪拍出的照片。

计算多样性指数(H)、均匀度指数(D)、丰富度指数(R)。

多样性指数(H)[11]的计算公式：

H=-∑(ni/N)In(ni/N);

E=H/InS;

R=S-1/InN。

式中：ni为单一条带的峰面积，N为某一泳道所有峰面积，S为某一泳道的总条带数。

2 结果分析

2.1 酵母菌微生物总DNA提取

分别取3 μL的DNA与0.5 μL的溴酚蓝缓冲溶液混合后点样，在110 V下电泳35 min，用紫外观察仪观察并拍照，结果见图1。

图1 酸菜微生物总DNA的提取

由图1可以看到清晰的1条带，说明成功提取到DNA，可以进行后续实验。

2.2 酵母菌PCR扩增条带

各取4种PCR产物3 μL，按照1.2.1的方法进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。

图2 26S rDNA的PCR电泳图

根据与Marker的对比可知DNA片段大小在270 bp左右，而且条带宽度、亮度都不一样，说明DNA浓度不一样。扩增产物在紫外成像仪下可以清晰地看到1条带，说明扩增成功，可以进行DGGE实验。

2.3 DGGE图谱分析

DGGE结果见图3。

图3 酸菜酵母菌26S rDNA的DGGE图谱

条带的宽度、亮度不同，表示DNA浓度不同。由图3可知，共检测出了13条带。酸菜1检测到3条带，但有效回收2条，如SA1、SA2，即有3种酵母菌；酸菜2检测出3条带SB1、SB2、SB3，即有3种酵母菌；酸菜3中检测出4条带，即有4种酵母菌；酸菜4中有3条带，即有3种酵母菌。说明酸菜3中酵母菌含量较丰富，但整体来说差距不是很大。SA2与SD2、SB2与SC2、SB1与SC1位置相同，为同一种酵母菌。酸菜A中SA2的亮度最亮，说明酵母菌SA2在酸菜A中含量丰富；酸菜B中SB2的亮度最亮，说明酵母菌SB2在酸菜B中含量丰富。可见，同一种酵母菌在不同的酸菜中丰富度不同。

2.3.1 酸菜样品酵母菌微生物群落结构特征

表2 酸菜样品酵母菌微生物群落结构特征

由表2可知，酸菜A，B，C的多样性指数高于酸菜D，说明其他3种酸菜酵母菌种类较D丰富；酸菜A的均匀度比其他3种酸菜较低；酸菜A，B的丰富度比C，D较低，说明酸菜C，D中酵母菌含量较丰富。综合比较酸菜C中的3项指标都较高，说明酸菜C中酵母菌丰富，且酵母菌种类丰富。

2.3.2 酸菜中酵母菌的聚类分析

图4 酸菜中26S rDNA片段的DGGE条带相似性聚类图

发酵酸菜DGGE电泳图谱DNA条带的聚类分析结果见图4，发酵全过程聚为两大类：酸菜2与酸菜3聚为一类，即SB、SC聚为一类；酸菜1和酸菜4聚为一类，即SA、SD聚为一类，说明酸菜中酵母菌大致归属于两大类群。

2.4 DGGE电泳分析及回收电泳带的鉴定

为了研究酸菜中的微生物种类，实验中回收亮度强的电泳带，通过对回收序列进行测序，并与GenBank库序列对比鉴定(见表3)。经鉴定，SA1、SA2、SB1、SB2、SC2、SC3、SD3分别与UnculturedKazachstania，Candidahumilis，Issatchenkiaoccidentalis，Pichiaoccidentalis，Issatchenkiaterricola，Saturnisporamendoncae，Saccharomycescerevisiae，相似度为87%、87%、99%、98%、89%、99%、99%。然后通过Mega 6软件构建系统发育树(见图5)。

表3 酸菜酵母菌DGGE条带序列结果

图5 酸菜中酵母菌系统发育树

由图5可知，SA2与UnculturedKazachstania形成一个分支，可信度达到91%，SC2与Issatchenkiaterricola形成一个分支，可信度达51%，SB1、SB2与Pichiaoccidentalis形成一个分支，可信度达66%，SA1与SA2和UnculturedKazachstania形成一个分支，可信度达到100%，SC3与其下方6条序列形成一个分支，可信度达98%。

3 讨论

酵母菌是酸菜中主要的微生物之一，因此也一直是主要的研究对象，酵母菌在酸菜的发酵工程中会影响其风味和质量。本实验采用非培养的方法，通过PCR-DGGE等分子生物学技术对酸菜中酵母菌进行研究。之前也有很多关于发酵蔬菜中微生物的研究。乌日娜等的研究表明酸菜中细菌含量较高，而真菌较少。武俊瑞研究发现德巴利汉逊酵母(Debaryomyceshansenii)是真菌中的优势种。有研究表明，在盐渍青菜中分离出10种酵母菌，有4种优势菌与假丝酵母属(Candida)、德巴氏酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)的菌株相似[12,13]。本实验则检测出UnculturedKazachstania，Candidahumilis，Issatchenkiaoccidentalis，Pichiaoccidentalis，Issatchenkiaterricola，Saturnisporamendoncae，Saccharomycescerevisiae等酵母菌。有一些是几种酸菜共有的，而有的是某种酸菜特有的。研究结果表明青菜酸菜中酵母菌多样性高，且酵母菌群落稳定存在。

本次研究的优势在于避免了传统培养方法易污染、菌种不完全等缺陷。在意大利香肠[14]、韩国泡菜[15]等的研究基础上，运用PCR-DGGE等技术研究泡菜中的酵母菌。本次研究也有一定的局限性，一些是实际操作中出现的问题，一些是技术上的问题。例如在操作中提取DNA、PCR、切胶等过程有可能造成DNA污染，或者由于操作的原因，使部分DNA分解，从而对目的菌种的种类和含量造成影响，这或许可以用来解释为何DGGE条带较少。不过这些非系统误差可以通过优化实验操作来完成。另外DGGE存在一定的局限性，它对经PCR扩增的DNA片段的长度、浓度等都有一定的要求，而且共迁移现象对测序来说存在困难。因此，本实验虽然测出了酸菜中一部分酵母菌的种类、分布，但仍不完全，有待于进一步的研究。