四氢嘧啶基因簇在假单胞菌基因组中的分布研究

李向阳何兰

四氢嘧啶基因簇在假单胞菌基因组中的分布研究

李向阳1，2，何兰1

（1.凯里学院 大健康学院，贵州 黔东南苗族侗族自治州 556011；2.复旦大学 环境科学与工程系，上海 200433）

四氢嘧啶（Ectoine）是由细菌产生的一种次级代谢产物，赋予细菌抵御高渗透压环境的一种相容性溶质。研究显示许多细菌具有四氢嘧啶基因簇（ectABCD-ask），然而关于该基因簇在假单胞菌属（Pseudomonas）中的分布还没有系统报道。鉴于此，以公共数据库中已测序的9 548株假单胞菌属菌株全基因组序列为数据，采用深度生物信息学分析方法探究假单胞菌中的四氢嘧啶基因簇分布及其组成共线性特征。结果显示165株假单胞菌携带有四氢嘧啶基因簇，占假单胞菌株总数的1.78%，归属于32个不同的种，超过一半的菌株属于施氏假单胞菌（P.stutzeri）；同一种内菌株间，ectABCD-ask及其侧翼基因高度保守，共线性水平程度高。系统地揭示了假单胞菌基因组中四氢嘧啶基因簇分布规律，将为开展生物合成四氢嘧啶提供重要菌种资源信息。

假单胞菌；基因组；四氢嘧啶；四氢嘧啶合成基因簇

四氢嘧啶（1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸）是由某些嗜盐和耐盐微生物生物合成的相容性溶质，能够赋予细菌抵御胞外高渗透压环境压力[1]。由于这些相容性溶质对蛋白质、细胞膜、核酸，甚至整个细胞都具有良好的稳定性能，因此在皮肤护理、食品加工、农业以及生物技术等领域具有广泛应用价值[1-2]。

假单胞菌（Pseudomonas）是一类革兰氏阴性菌，广泛分布于空气、土壤、水中等各种环境中，假单胞菌属种类繁多，约200余种[3-4]，其中不乏有对人体造成危害的种类，例如铜绿假单胞菌可引起慢性感染[5]。根据本研究团队前期相关研究显示，一些斯氏假单胞菌（P.stutzeri）携带有由ectA、ectB、ectC、ectD、ask_ect 呈簇分布的基因组成的四氢嘧啶生物基因簇[6]，如生物固氮菌P.stutzeri A1501[7]和砷氧化菌株P.stutzeri TS44[8]。该基因簇能够以L-天冬氨酸β半醛（ASA）为前体物质，通过二氨基丁酸转氨酶（由ectB基因编码）、二氨基丁酸乙酰转移酶（由ectA基因编码）和四氢嘧啶合成酶（由ectC基因编码）进行一系列的生物化学反应最终合成四氢嘧啶[1]。

随着高通量基因组测序技术的发展，使得细菌全基因组序列所需的时间和成本急剧下降。目前美国国立生物信息与技术中心（NCBI）基因组数据库中已有将近10 000株假单胞菌属菌株完成了全基因组序列测定，因而利用大量基因组系统分析四氢嘧啶基因簇在该属菌株基因中的分布、组成及侧翼序列共线性成为可能。

1 材料与方法

1.1 物信息学平台

在惠普服务器DL388G9中安装有Bio-Linux系统[9]，该系统集成了常用生物信息学分析软件。主要硬件配置为：CPU为双核16线程，内存容量128 GB，硬盘存储总容量10 TB。本研究所有分析均使用该服务器完成。

1.2 假单胞菌基因组序列批量获取

本研究以NCBI基因组资源库中已测序的9 548株假单胞菌全基因组为实验数据。具体获取方法如下：打开NCBI基因组FTP资源库网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ browse/，输入假单胞菌属名“Pseudomonas”进行检索，共获得9 548个基因组信息列表；下载基因组信息列表文件后，采用Excel软件打开从中获取所有假单胞菌属菌株基因组数据FTP存储地址和菌株名列表；然后根据每一个基因组数据的FTP地址，采用Aspera（https://downloads.asperasoft.com）高速批量下载所有假单胞菌属菌株基因组数据（Genbank 格式）。

1.3 四氢嘧啶基因簇分布分析

本研究结合ectC基因预筛选和基因簇可视化复筛方法分析四氢嘧啶基因簇在所有已测序假单胞菌中的分布情况。

ectC预筛选：ectC是四氢嘧啶合成酶基因簇关键基因，该基因编码四氢嘧啶合成酶，为了减少计算量，首先分析ectC基因在假单胞菌中的分布情况。将所有9 548个基因组序列文件批量解压后，采用Gcluster[10]软件中自带的interested_gene_generation.pl脚本获取菌株携带的候选四氢嘧啶合成酶编码基因。

interested_gene_generation.pl主要利用本地Blastp方法来分析同源基因，其主要分析过程为：批量提取所有基因组的蛋白组编码基因的氨基酸序列，然后以P.stutzeri A501四氢嘧啶合成酶基因ectC氨基酸序列为数据库，采用16个线程多线程进行本地Blastp分析，最后根据BlastP设定的同源蛋白默认阈值（期望值=1-e10，覆盖度≥70%，相似度≥50%），对结果进行解析，即可获得所有假单胞菌中所有潜在ectC基因分布情况。

基因簇可视化复筛：为了进一步排除低质量ectC比对结果，采用Gcluster软件对所有含有候选ectC基因的假单胞菌进行ectABCD-ask基因簇及其侧翼序列进行可视化与比较分析，具体操作方法详见该软件使用说明（https://github. com/Xiangyang1984/Gcluster）。对获得的结果进行手工筛选，确定含有完整ectABCD-ask基因簇的为有效携带四氢嘧啶合成酶基因簇的菌株。

1.4 四氢嘧啶基因簇侧翼序列比较

将所有含有完整四氢嘧啶基因簇的假单胞菌基因组GenBank文件置于同一个文件夹下，并从“1.2 ectC预筛选”步骤中获得相应基因组的ectC基因Locus tag，然后根据Gcluster默认设置参数对ectABCD-ask基因簇及其侧翼序列进行基因组成图绘制，同时开展同源基因分析。

2 结果与分析

2.1 四氢嘧啶合成酶基因簇在假单胞菌属菌株中的分布

经以P.stutzeri A1501 ectC蛋白质序列为数据库进行Blastp比对分析，发现553株假单胞菌含有潜在ectC基因。为了排除假阳性，采用Gcluster软件对所有553株菌的四氢嘧啶合成酶基因簇进行可视化，并进行手工核对，结果显示541个（分布在541株假单胞菌中）为真正的四氢嘧啶合成酶基因ectC。在这些菌株中，绝大多数菌株（346株，占比为63.96%）只携带有单一的ectC基因，而没有完整的ectABCD-ask基因；仅有165株假单胞菌含有完整的ectABCD-ask基因簇，占所有假单胞菌属菌株总数的1.73%（165/9 548）。携带ect基因簇的菌株归属于29个不同的种以及一些未知种，超过一半的菌株属于施氏假单胞菌（P.stutzeri），并且所有的施氏假单胞菌均携带有四氢嘧啶基因簇。

2.2 四氢嘧啶基因簇及其侧翼序列共线性

对165株假单胞菌的生物合成基因簇ectABCD-ask及侧翼20个基因进行分析显示，ect基因簇由ectA、ectB、ectC、ectD、ask共5个基因组成。在部分菌株存在个别基因缺失，如Pseudomonas sp. A3170、Pseudomonas sp. CCUG 58779、Pseudomonas sp. SD129、P.stutzeri 28a24、P. stutzeri 28a3、P. stutzeri DSM 17088、P. stutzeri MF28、P. stutzeri NT0128、P. stutzeri PM101005等菌株不存在ectA基因，并且ectB基因较长；P.oceani DSM 100277、P. aestusnigri CECT 8317和P.aestusnigri VGXO14缺失ectD基因；P.stutzeri NP 8HO、P.yangmingensis DSM 24213等7个菌株不含有ask基因。

在同一种内菌株间，ectABCD-ask及其侧翼基因高度保守，共线性水平程度高；在不同种间菌株之间，该基因簇左侧基因序列保守型高，但右侧基因差异较大。

3 结束语

本研究首次利用大量假单胞菌属基因组序列数据，系统地分析了四氢嘧啶基因簇的分布规律，并对其基因组成及侧翼基因进行了共线性分析。研究发现四氢嘧啶基因簇在假单胞菌基因组中分布频率极低，证明假单胞菌不是该基因簇的主要宿主。超过一半的四氢嘧啶基因簇分布在施氏假单胞菌中，并且所有施氏假单胞菌全部携带有四氢嘧啶基因簇，因此在假单胞菌中，施氏假单胞菌是携带四氢嘧啶基因簇的宿主。本结果对深入理解四氢嘧啶基因簇在假单胞菌属中的分布规律具有一定价值，为生物合成四氢嘧啶筛选菌株资源提供了重要信息[11-12]。

［1］ZHAO Q，LI S，LV P，et al. High ectoine production by an engineered Halomonas hydrothermalis Y2 in a reduced salinity medium［J］.Microb Cell Fact，2019，18（1）：184.

［2］刘伟.四氢嘧啶类抗寄生虫药在兽医临床上的应用［J］.畜牧兽医科技信息，2018（10）：158.

［3］李海碧.甘蔗根际假单胞菌的分离鉴定及其对甘蔗的促生作用［D］.南宁：广西大学，2017.

［4］刘海明.甜椒根际合成抗生素假单胞菌遗传多样性分析及GP72菌株生防机制研究［D］.上海：上海交通大学，2007.

［5］丁烨，戴璐，俞娟.抗铜绿假单胞菌感染治疗方法研究进展［J］.中华医院感染学杂志，2020（6）：955-960.

［6］李向阳，张国辉，汤宏.施氏假单胞菌四氢嘧啶/羟基四氢嘧啶合成基因簇进化分析［J］.凯里学院学报，2015，33（6）：70-73.

［7］STOVEKEN N，PITTELKOW M，SINNER T，et al.A specialized aspartokinase enhances the biosynthesis of the osmoprotectants ectoine and hydroxyectoine in Pseudomonas stutzeri A1501［J］.J Bacteriol，2011，193（17）：4456-4468.

［8］LI X，GONG J，HU Y，et al.Genome sequence of the moderately halotolerant，arsenite-oxidizing bacterium Pseudomonas stutzeri TS44［J］.J Bacteriol，2012，194（16）：4473-4486.

［9］FIELD D，TIWARI B，BOOTH T，et al.Open software for biologists：from famine to feast［J］.Nat Biotechnol， 2006，24（7）：801-803.

［10］LI X，CHEN F，CHEN Y.Gcluster：a simple-to-use tool for visualizing and comparing genome contexts for numerous genomes［J］.Bioinformatics，2020（28）：40.

［11］高波.吉兰泰盐湖土壤中嗜盐碱放线菌的分离鉴定及四氢嘧啶工程菌株的构建［D］.咸阳：西北农林科技大学，2016.

［12］徐蕊.四氢嘧啶合成工程菌株构建［D］.大连：大连海事大学，2012.

S476

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.058

2095－6835（2020）12－0132－02

李向阳（1984—），男，凯里学院大健康学院副教授，复旦大学环境科学与工程系在职博士后，研究方向为环境微生物学及生物信息学。

〔编辑：张思楠〕