进境茶梅中山茶叶杯菌的检疫鉴定

段维军，段丽君，刘芳，吕燕，赵鹏，蔡磊

(1.宁波检验检疫科学技术研究院，浙江宁波 315012；2.中华人民共和国宁波海关，浙江宁波 315012；3.宁波中盛产品检测有限公司，浙江宁波 315012；4.中国科学院微生物研究所，北京 100101)

茶梅Camellia sasanqua是山茶科Camelliaceae山茶属Camellia植物[1]，冬季和春季开花，盛花期在冬季，是寒冬时期少有的开花植物，具有较高观赏价值[2]。茶梅既可与多种植物搭配作为绿色景观使用，也可作为家装植物，供室内观赏，用途广泛[3]。近年来，由于国内绿化美化产业的发展，我国从日本进口茶梅数量不断增加，同时伴随着携带有害生物入侵的隐患也日益加大，需高度重视。

山茶花腐病是山茶属植物最严重的病害[4]。1919年，Hara将日本首次发现的山茶花腐病病原命名为山茶核盘菌Sclerotinia camelliaeHara，隶属于核盘菌科Sclerotiniaceae[5]。1940年，美国加利福尼亚州多个山茶属植物苗圃也报道了该病的发生，由于20世纪初期信息传播受限，在不了解Hara所做工作的情况下，Hansen＆Thomas将该病病原命名为Sclerotinia camelliaeHansen＆Thomas[6]。但不久，Hansen＆Thomas发现他们所描述的山茶花腐病病原的子囊和子囊孢子比Hara所描述的种要小一些[7]。1945年，Whetzel将核盘菌科划分为14个属[8]，其中的叶杯菌属Ciborinia的主要特点在于所产生的菌核与寄主组织部分或全部紧密结合在一起；而该科其它产菌核的真菌，如引起作物菌核病的核盘菌属SclerotiniaFuckel，引起果树叶、花和果实病害的链核盘菌属MoniliniaHoney，以及引起蔬菜和其它作物病害的葡萄孢盘菌属BotryotiniaWhetzel，它们的菌核均单独产生，不能与寄主组织紧密结合在一起[9]。1979年，Kohn比较Hara的模式标本和从加利福尼亚新鲜采集的标本，推断它们是两个不同的种类，并将加利福尼亚的标本命名为Ciborinia camelliaeKohn[10]。但1984年，Kohn＆Nagasawa研究Sclerotinia camelliaeHara和Ciborinia camelliaeKohn的模式标本后，提出这二种标本为同物异名的观点[11]。按照目前的分类系统，山茶叶杯菌隶属于真菌界Fungi子囊菌门Ascomycota子囊菌纲Ascomycetes柔膜菌目Helotiales核盘菌科Sclerotiniaceae 叶杯菌属Ciborinia[9，12]，应采用Ciborinia camelliaeKohn一名。

山茶叶杯菌Ciborinia camelliaeKohn(异名Sclerotinia camelliaeHara)只侵染山茶花Camellia japonica、南山茶Camellia reticulata、茶梅等[4，11，13]山茶属植物的花朵而不侵染其它部位。受其侵染，花朵变褐色，花期缩短并提前脱落[11]。山茶属植物为观花植物，主要价值在于花朵，因此该病害严重影响其观赏和经济价值。与其它观花植物相比，山茶属植物的病虫害相对较少[14-15]。山茶叶杯菌在侵染后期可形成抗逆性较强的菌核，化学药剂难以防治，这对其寄主植物构成了严重威胁。鉴于其严重危害性，该病菌已被列入欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO)的A1类有害生物，也被列入我国进境植物检疫有害生物名录，称之为山茶花腐病菌，须密切防范其传播扩散。

尽管山茶花腐病早在1919年于日本发现[5]，但在20世纪70年代中期之前并没有被广泛传播[16]。目前，山茶叶杯菌主要分布于北美洲的美国，欧洲多国，大洋州的新西兰以及亚洲的日本[17-22]。迄今为止，我国未见该病害的报道。

2019年初，宁波口岸对自日本进境的6株茶梅树种苗进行口岸检疫时，发现茶梅树上携带有带菌核茶梅花，随即将茶梅花样品送至实验室检测。通过对该批样品分离培养，获得1株疑似山茶叶杯菌CM-2菌株，笔者对其开展生物学特性研究、DNA序列测定分析和致病性测定，准确鉴定该菌株的分类地位，以期为口岸检疫、疫情防控及相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 采用常规PDA平板分离法从日本进境的茶梅花朵样品携带的多个菌核中，分离培养获得1株疑似山茶叶杯菌的菌株。菌株经切取培养中菌丝尖端后得到纯化菌株CM-2，接种在PDA斜面，于4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养基对菌落形态的影响 选用马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)、燕麦琼脂(oatmeal agar，OA)、麦芽汁琼脂(malt extract agar，MEA)[23]和茶梅花水琼脂(camellia water agar，CWA)4种培养基进行实验。CWA培养基制备方法为茶梅花20 g，加水，打碎匀浆过滤后，加琼脂粉20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，灭菌后备用。将供试菌株CM-2分别接种于不同培养基平板中央，在18℃条件下连续暗培养10 d，观察记录菌落正反面的颜色和气生菌丝的疏密程度。用解剖针自4种平板上挑取供试菌，制临时水玻片后在Imager Z1自动正立照相显微镜(德国Zeiss公司)下观察有性繁殖结构有无和无性繁殖结构微观形态特征，并利用显微数码测量系统测量微观形态特征并记录。

1.2.2 基因组DNA提取 用灭菌枪头刮取PDA平板上培养10 d的CM-2的菌丝体，按照Labserv Plant DNA Kit核酸提取试剂盒(美国Thermo Fisher公司)使用说明书，在Kingfisher核酸自动化提取仪(美国Thermo Fisher公司)上提取基因组DNA。提取后DNA经Thermo Scientific Multiskan GO生物分光光度计(美国Thermo Fisher公司)检测浓度后，冻存于-20℃冰箱备用。

1.2.3 序列测定 采用White等[24]设计的引物ITS1和ITS4进行ITS片段扩增，采用Vilgalys[25]设计的引物LR0R和LR5R进行28S片段扩增，采用引物TUB2Fd/TUB4Rd扩增β-tubulin(TUB)片段[26]，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像系统进行拍照，按照DNA片段纯化试剂盒说明书进行纯化。纯化产物送北京六合华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.4 序列比对分析 测序获得的序列首先运用Bioedit ver.7.0.9[27]对正反向序列进行手动的拼接合成，同时在GenBank中下载叶杯菌属及其近似种的ITS、28S和 TUB序列作为对照，用 Clustal X ver.1.8[28]对多个样本的序列进行比对，以大丽轮枝菌Verticillium dahliae的ITS序列(AJ970308和EU109532)为外群，分别运用RAxML ver.7.2.6[29]和MrBayes ver.3.1.2[30]软件采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)和贝叶斯分析(Bayesian inferences)进行ITS序列系统发育树的构建。

1.2.5 致病性测定 选用市售本地盆栽茶梅品种“立寒”1株进行接种试验。取接种菌株CM-2培养20 d的PDA平板，用直径10 mm打孔器打取菌饼后，用解剖针在花朵基部扎成深度1 cm伤口，采用靠接法将菌饼接种茶梅花朵基部伤口位置，共接种4朵。以接种无菌PDA平板菌饼作为对照，设对照花朵4朵。接种后在接种部位放置湿润棉球，将茶梅花套上塑料袋保湿48 h后移除塑料袋。供试茶梅放置在20℃温室条件下培养，接种后每天观察并记录发病情况。对发病花朵进行病原菌再分离和TUB序列测定。

2 结果与分析

2.1 症状观察 送检茶梅花瓣变褐坏死，但花的结构保持良好，枯萎花朵挤压后花瓣不脱落。花上肉眼可见有黑色菌核产生，与花组织紧密结合在一起(图1)。

成熟的菌核薄片状、盘状或浅杯状，外部深褐色或黑色，菌核边缘因为与花瓣寄主组织结合而呈褐色(图2)，切开后可见菌核内部为白色或浅褐色。菌核多单独产生，但在花朵基部，由于寄主花萼作用可将多个菌核粘连在一起。

图2 山茶叶杯菌的菌核Fig.2 Sclerotia of Ciborinia camelliae

2.2 菌株CM-2的菌落性状和形态特征 在MEA上，生长十分缓慢，未见菌核(图3A)。在PDA上，初期菌落呈白色，粗糙、质地较硬、毡状，菌落边缘不规则，2周左右开始产生菌核结构，菌核产于培养基表面；菌核卵圆形或椭圆形，大小(1.86～12.30)mm×(1.37～8.20)mm；菌核单独或聚集生长，未成熟时白色，随时间延长，逐渐呈深褐色或黑色(图3B)。在OA上，生长速度较快，初期菌落呈白色，在培养基上产生淡黄褐色色素，气生菌丝稀少，产生大量黑色菌核；菌核大小(2.10～14.50)mm×(2.50～10.83)mm，聚集或单独产生(图3C)。在CWA上，气生菌丝稀少，不易观察，但透光后可看到稀薄菌落，菌落生长速度较慢，可产生菌核；菌核呈近似圆状，大小(1.20～3.00)mm×(1.37～4.10)mm，产于培养基底部，单生分布于菌落边缘(图3D，H)。以OA上产生菌核最大，其次为PDA，CWA上产生菌核最小。

图3 菌株CM－2在MEA，PDA，OA和CWA培养基上培养10 d后的菌落和形态特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of strain CM －2 on MEA，PDA，OA and CWA media after 10 days

在4种培养基上均未见有性阶段和大型分生孢子。在PDA或OA培养基上可观察到无性繁殖结构。分生孢子梗瓶梗状，透明至浅褐色，在分生孢子梗顶端产生小型分生孢子。小型分生孢子圆形至卵圆形，单核，直径2.3～4.2 μm，含一个油球；有些孢子可连接成短链(图4)。

图4 山茶叶杯菌菌株CM－2在PDA上的微观形态Fig.4 Micromorphological characteristics of Ciborinia camelliae isolate CM－2 on PDA

2.3 DNA序列分析 经真菌ITS、28S和TUB序列相关引物扩增后，分别获得长度为513、1157和476 bp的基因片段。经在GenBank中BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)搜索和比对分析，供试菌株CM-2的ITS序列与GenBank中山茶叶杯菌ITS序列(AB516659、FJ959095～FJ959098)的同源性为99%，28S序列与GenBank中山茶叶杯菌的28S序列(KF590160)同源性为99%，TUB序列与 GenBank中山茶叶杯菌的 TUB序列(GQ181121、GQ181122)同源性达100%。最大似然法和贝叶斯分析的树拓扑结构一致，供试菌株CM-2的ITS序列与山茶叶杯菌菌株EFA-2和EFA-4的ITS序列聚在同一个分支(Bootstrap值为0.93/94)(图5)，28S序列与TUB序列系统发育分析结果也表明CM-2与山茶叶杯菌聚在同一个分支。形态学观察初步明确该菌具有侵染茶梅花朵、与寄主花瓣紧密结合形成薄片状、盘状或浅杯状菌核等形态特征，为山茶叶杯菌的特有特征。由于该菌为我国进境检疫性有害生物，获取模式菌株的难度较大，但结合分子及形态依据，可以确认该菌为山茶叶杯菌。

图5 基于ITS基因序列构建山茶叶杯菌菌株CM－2及其相关菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree generated from ITS sequences of Ciborinia camelliae strain CM－2 and related species

2.4 致病性 接种菌株CM-2茶梅花朵早期症状不明显。接种50 d后，将花倒置，可见花瓣基部有白色毛毯状近似环状的菌丝体。被侵染的花在脱落后仍能保持其形状和硬度，干枯花瓣有质地较硬块状物，外部有菌丝产生，后期可见菌核(图6A)，与寄主组织紧密结合在一起。除接种花朵外，未观察到花朵之间相互传染。接种无病菌PDA平板的对照茶梅花上没有产生上述症状(图6B)。经茶梅花叶部再分离、培养并测序获得了与原病菌形态和TUB序列一致的菌株。

图6 山茶叶杯菌菌株CM－2接种茶梅花瓣后所致症状及对照Fig.6 Symptoms of Ciborinia camelliae isolate CM－2 on flower of Camellia sasanqua

3 结论与讨论

根据形态学特征观察、序列比对分析以及致病性测定的结果，将从日本进境的茶梅花朵上截获的菌核病菌鉴定为山茶叶杯菌，这是我国首次截获山茶叶杯菌这一进境检疫性有害生物。该结果可为该病菌的疫情检测、监测和防控提供依据。

叶杯菌属可以寄生在草本植物的茎、球茎、匍匐茎、叶柄、花总枝、花瓣和萼片上，以及木本植物的叶和花上[9]，目前已报道种类24种，寄生茶梅的仅有一种[9，12]。叶杯菌属与核盘菌属的主要区别在于菌核部分或全部埋生于寄主组织或培养基中，髓部含有未经消化的寄主组织。该属真菌在我国研究较少，目前我国仅报道有3种，葱叶杯菌Ciborinia allii[31]、半球叶杯菌Ciborinia hemisphaerica和井冈山叶杯菌Ciborinia jinggangensis[32]。国际上，该属真菌分子生物学相关研究较少，GenBank中该属真菌仅有个别种类有少量DNA序列证据，如GenBank中山茶叶杯菌仅有2条TUB序列、5条ITS序列、2条28S序列。

山茶花腐病的主要症状是寄主植物花瓣变褐、花坏死，并能在短期内迅速扩展，造成茶梅花期缩短，花朵脱落，严重影响观赏价值[21，33]。通常在早春阶段由病原菌子囊孢子侵染花朵基部，形成棕色小斑点，斑点逐步扩展后蔓延至整个花瓣，花瓣边缘腐烂。严重时，花朵中部变黑，完全坏死，最终脱落，但花的结构保持良好。在花被侵染的后期，将花倒置并移除萼片，可见围绕花瓣基部出现白色至灰白色毛毯状近似环状的不育菌丝体，像寄主的组织，该环状菌丝体是该病害的一个典型特征[13，34]。感染后2～4周，菌核开始形成，最初由一层密集的灰白色菌丝覆盖。成熟的菌核，黑色，较薄，近盘状。用手指揉搓花瓣基部，可以检测菌核为坚硬平坦的结构，菌核有助于病菌度过不良环境。菌核随花朵脱落在泥土后，落花腐烂，菌核混入土壤中[20]。菌核在冬季结束时萌发产生子囊，释放子囊孢子后，侵染新花，构成侵染循环[22]。该病害药剂防治难度较大，菌核具有较强抵御不利环境影响的能力，传统药剂防治方法难以奏效。

该病菌的检疫工作，首先应该观察进境茶梅等种苗花朵或介质是否携带有菌核。通过比较可发现山茶叶杯菌菌核与一般菌核明显不同，山茶叶杯菌菌核卵圆形或饼形，且与寄主花瓣紧密结合在一起。在口岸检疫中另两种能够侵染茶梅且可产菌核的病菌，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea和核盘菌Sclerotinia sclerotiorum所产生菌核均为球状较厚菌核，且不与寄主组织相结合，这与扁平状的山茶叶杯菌菌核明显不同。同时，灰葡萄孢菌和核盘菌侵染的花瓣易碎，多提前掉落。菌核是否与寄主组织相结合是区分山茶叶杯菌的一个重要指征。在分离鉴定时，通过花瓣直接分离山茶叶杯菌的成功率较低，而通过菌核分离病菌的成功率较高。该菌在培养基上可供检测鉴定的形态特征主要是菌核和小型分生孢子形态，但这些特征形态并不稳定。如Hansen＆Thomas[6]报道该菌菌核直径可达20 mm×30 mm，而Gill[35]报道菌核直径为12～25 mm，本次在宁波口岸截获的山茶叶杯菌菌核较上述报道均小。在有性态方面，Hansen＆Thomas[6]报道子囊孢子大小为(5.3～7.0)μm×(2.5～3.5)μm，小于 Kohn＆Nagasawa[11]所报道的，而Yoshimi[36]报道的子囊孢子大小为(12～13)μm×(6～8)μm。本研究中，菌株CM-2经过培养仅产生小型分生孢子和菌核，实验室条件下未能观察到大型分生孢子和有性态。ITS、28S和TUB序列测定表明该菌株与GenBank中山茶叶杯菌序列相似度较高，根据ITS、28S和TUB序列构建的系统发育树也支持将分离物CM-2划分在山茶叶杯菌分支，从分子水平进一步确认了形态学结果。致病性测定结果表明该菌株能够侵染茶梅花朵，造成花朵枯死并形成菌核。以上证据支持将所截获病菌鉴定为山茶叶杯菌。为了提高检测效率，缩短通关时间，可以在测定山茶叶杯菌及其近似种多基因序列基础上，进一步研究其快速检测方法，利用菌核提取DNA进行实时荧光PCR检测等方法可加快实验室检测流程。

山茶叶杯菌侵染花朵的最适温度是15～18℃，但也可在10～24℃快速侵染寄主植物花朵[37]。在更低温度下病菌可侵染花朵但没有明显外部症状，若遇外部环境温度升高，则病害症状将会显现，这说明病菌可能通过无肉眼可见症状的鲜切花进行传播[33]。根据英国皇家园艺学会推荐，应该禁止从山茶叶杯菌发生国家或地区进口带有开放花朵的茶梅切花[33]。同时，EPPO建议应该充分考虑带有土壤或介质的植物携带菌核的风险，建议山茶花种植者对来自山茶叶杯菌发生国家进口的任何植物仔细观察18个月[38]。这表明从山茶叶杯菌发生疫区国进口山茶属植物具有很大风险，应该进一步慎重评估。

茶梅、山茶等山茶属植物，作为一类优良的景观植物，在园林绿化中有广阔的发展前景，该属植物还有一定食用和药用价值。目前山茶叶杯菌仅在观赏类山茶花属植物有所报道，对于该属中其它一些种类，如广泛种植并饮用的茶Camellia sinensis，产茶油的油茶Camellia oleifera等植物上能否致病，尚有待进一步研究。日本种苗景观植物品质较高，近年来由于国内市场旺盛需求，我国进口了大量日本种苗，主要种类包括罗汉松Podocarpus macrophyllus、鸡爪槭Acer palmatum、杜鹃Rhododendron simsii和茶梅等。对这些进境植物产品进行严格检疫是保护我国农林业生产发展的重要举措，我国口岸检疫部门已经多次从来自日本种苗中截获检疫性真菌，如自罗汉松中截获可可花瘿病菌Albonectria rigidiuscula[39]、杜鹃中截获杜鹃花枯萎病菌Ovulinia azaleae[40]和鸡爪槭中截获葡萄茎枯病菌Didymella glomerata[41]等。由于菌核能够在没有山茶属植物存在情况下造成该病菌的传播，因此单独针对山茶属植物的单一检疫措施并不能有效阻断该病菌的发生。此次截获表明，从日本进口茶梅等山茶属植物种苗或介质中具有携带山茶叶杯菌的较高风险，今后应加强对该类产品上检疫性病菌的检疫工作，以防范其危害。同时，也应尽快调查监测我国山茶属植物上是否存在该病菌，以阻止其传播扩散危害。

志谢:感谢中科院微生物研究所庄文颖研究员在病菌鉴定过程中提供的指导与帮助。