工业微生物乙酸响应与调控机制的研究进展

程国平,陈 琛,李必金,李 岩

(廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北 廊坊 065001)

乙酸是一种酸性较弱的有机酸,具有一定的毒性作用,在较低质量浓度下即可抑制微生物的生长和代谢[1],乙酸所具有的这种抑菌性作用使其可用作防腐剂,广泛用于食品行业。乙酸对微生物产生毒性作用的原因主要是其在细胞内部发生解离,降低胞内pH值,使胞内环境酸化,严重影响微生物的物质合成、金属转运和能量传递等过程,进而导致细胞受损[2],这制约了以微生物发酵技术为基础的工业生产过程。从这个角度上讲,提高工业微生物对乙酸的耐受性对于工业生产过程具有重要意义。

微生物在乙酸胁迫下具有相应的响应与调控机制,从而尽可能减少乙酸带来的负面影响,因此需要理解乙酸对工业微生物的主要影响以及微生物响应乙酸胁迫的相关机制。鉴于此,笔者选取了3种广泛应用于发酵领域的工业微生物,包括酿酒酵母、大肠杆菌及谷氨酸棒状杆菌,并在其乙酸响应机制方面进行了细致讨论。目前,这3种工业微生物已经有许多关于乙酸毒性作用及微生物在乙酸压力下响应与调控反应的研究[3-4],这些信息能够增加对乙酸耐受性的了解,并且有助于开发耐乙酸的工业菌株。笔者对这3种工业微生物的乙酸响应和耐受机制进行了系统性综述,重点从乙酸对微生物的毒害作用及微生物应对乙酸胁迫时所作出的有效调控这两方面进行阐述,列举了近些年国内外学者的最新理论与突破性进展,这将为克服乙酸干扰的工业生产过程提供重要的借鉴意义。

1 乙酸毒性机理

1.1 乙酸积累

木质纤维素原料价格低廉、来源广泛且成分丰富,其经过预处理后形成的水解液中含有大量的可溶性糖类物质,因此广泛用于微生物发酵领域。然而,在木质纤维素预处理过程中,由于原料自身的结构特点以及降解程度的不可控性,会不可避免地产生各种抑制微生物生长的化合物[5],这些化合物会通过抑制微生物的生长和物质代谢来影响生物发酵过程[6]。在这些抑制剂中,乙酸所占的质量比最高,有关研究表明:水解液中乙酸质量浓度大约为1～10 g/L[7],因此提高微生物对乙酸的耐受性是微生物高效利用木质纤维素原料进行生物转化的必要条件。同时,在工业生产中乙酸也作为副产物或溢流代谢产物而产生,例如酿造及食品工业中酿酒酵母在代谢过程中会产生乙酸,氨基酸和核苷酸发酵生产中大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌在培养过程中也会积累乙酸,乙酸代谢生成途径为

其中:PEP为Phosphoenolpyruvate(磷酸烯醇式丙酮酸);Pyr为Pyruvate(丙酮酸);AcCoA为Acetyl-CoA(乙酰辅酶A);POXB为Pyruvate oxidase(丙酮酸氧化酶);CTF为CoA-transferase(辅酶A转移酶);PTA为Phosphotransacetylase(磷酸转乙酰酶);ACK为Acetate kinase(乙酸激酶)。

通常情况下,乙酸的产生一方面是由于需氧型微生物在面临氧气缺乏时以乙酰辅酶A为底物,产生乙酸和ATP,ATP供细胞使用来满足自身能量需求[8];另一方面即使氧气供应充足,也有可能会积累乙酸,这是因为在有氧条件下,NADH除了通过呼吸链将电子传递给氧而重新氧化外,还通过发酵途径来氧化,造成某种产物积累的过程,如乳酸发酵或酒精发酵,即当微生物呼吸受限,葡萄糖吸收速率高于呼吸链对NADH的氧化速率,过剩的还原力会导致乙酸的溢流[9],从而影响工业微生物的生物量积累及代谢活性,降低目标生物产品的最终产量。

1.2 乙酸扩散及胞内解离

乙酸的酸离解常数pKa值为4.75。根据Henderson-Hasselbalch方程[10],pKa与溶液pH值及乙酸质子化和离子形式的量有关。当溶液pH值等于pKa值时,约50%的乙酸处于未解离形式(CH3COOH)。当溶液pH低于4.75时,大多数乙酸以其分子形成存在,如pH为3.75时,约90%的乙酸被质子化,而pH为2.75时,约99%的乙酸被质子化。由于未解离的乙酸分子具有亲脂性特点,很容易通过扩散作用而透过细胞质膜,已有的研究表明在酿酒酵母中乙酸也可以通过由水甘油通道蛋白Fps1p介导的促进扩散作用而进入胞内[11]。之后乙酸分子在细胞质中解离,氢离子(H+)与醋酸根(CH3COO-)被释放,导致细胞内部酸化。因此乙酸主要是以未解离形式对细胞产生负面影响,这与强酸(如HCl)产生的影响明显不同,强酸在培养基中以离子形式存在,尽管能够使培养基酸化而改变细胞生长的外环境,但因为离子扩散能力较差,无法穿过细胞质膜,细胞质无法被酸化,所以单纯降低培养基的pH值所产生的抑制远低于有机弱酸在胞内进行酸化而产生的抑制。

1.3 乙酸对细胞的毒性机制

乙酸的毒性作用严重影响微生物生长与物质代谢过程。Casey等[12]研究显示乙酸能够抑制酿酒酵母对葡萄糖与木糖的利用,因此生长受限;Contiero等[13]研究了当乙酸质量浓度超过1 g/L时,即会抑制大肠杆菌生物量的积累,进而影响重组蛋白的生产。对于谷氨酸棒状杆菌,尽管能够以乙酸作为碳源进行代谢,但是较低质量浓度的乙酸仍会抑制谷氨酸棒状杆菌的生长[14]。乙酸对细胞的毒性机制主要体现在3个方面:

1) 乙酸分子进入细胞使胞内环境酸化,会影响蛋白质合成与氨基酸代谢。Li等[15]研究了乙酸影响酿酒酵母中与组氨酸、精氨酸和色氨酸合成有关的酶系,因此胞内氨基酸代谢出现异常;Ding等[16]发现酿酒酵母培养基中添加含有乙酸的抑制剂后,与蛋白质降解有关的基因表达上调,通过分析推测出含有乙酸的抑制剂会造成酿酒酵母的胞内蛋白变性,从而影响细胞的正常生理功能;Han等[17]研究了当大肠杆菌受到乙酸的胁迫时,通过补加甲硫氨酸可以减弱由乙酸引起的抑制效果,但相关机制并不清晰,直到2008年,Mordukhova等[18]表明乙酸可能会抑制甲硫氨酸生物合成的相关酶,不仅阻止了甲硫氨酸的生物合成,而且导致有毒中间产物高半胱氨酸的积累,因此严重影响了大肠杆菌正常生长及胞内物质代谢过程。

2) 乙酸对微生物的能量代谢会产生负面影响,使微生物所需的能量减少,因此生长受到抑制。Pearce等[19]表明酿酒酵母胞内的酸化环境不利于糖酵解途径的进行,因此减弱了细胞产生ATP的能力;Ding等[16]研究了在乙酸影响下,酿酒酵母中与能量产生有关的酶表达下调,因此细胞出现了生长停滞现象。另外,乙酸在胞内解离后,细胞为抵消内部酸化及阴离子积累会作出相应的抗胁迫反应,即通过质子泵与相关转运蛋白分别将H+与CH3COO-泵出胞外,但这需要ATP的水解,因此消耗了大量能量。然而,被泵出胞外的H+与CH3COO-在外界较低的pH下会重新结合为乙酸分子,并可能通过扩散作用再次进入胞内并发生解离,这就形成了ATP不断消耗的无用循环,导致细胞所需的能量供应减少,从而抑制了细胞生长和代谢。

3) 乙酸在其他方面也会影响微生物生长及代谢。Wolfe[20]表明在大肠杆菌中,乙酸在胞内解离后阴离子的积累增加了细胞内部渗透压,不利于代谢反应的进行。乙酸会诱导酿酒酵母内部氧化应激,产生大量氧化中间产物(ROS),导致细胞受到损伤[21]。Ding等[22]研究了在乙酸胁迫下酿酒酵母摄取培养基中营养物质的能力下降,这并不利于细胞生长。

2 乙酸耐受机制

微生物已进化出不同的机制来应对乙酸带来的胁迫作用。耐乙酸机制大致分为:通过对乙酸进行分解代谢降低其质量浓度,阻止乙酸进入胞内,将胞内的氢离子及醋酸根阴离子转运至胞外。

2.1 乙酸代谢

微生物能够以乙酸作为碳源进行物质代谢,因此可有效地降低培养基中乙酸的质量浓度。不同微生物对乙酸的分解代谢具有一定差异:在葡萄糖存在下,酿酒酵母中与乙酸分解代谢相关的酶被强烈抑制,因此酿酒酵母难以代谢乙酸[23],只能通过其他机制来减弱乙酸引起的毒害作用,这种情况与大肠杆菌K-12类似。然而,并非所有大肠杆菌都具有这种严格的分解代谢产物阻遏机制,例如大肠杆菌BL21会同时消耗葡萄糖和乙酸,乙酸在乙酸激酶ACK和磷酸转乙酰酶PTA的催化作用下形成乙酰辅酶A,之后进入三羧酸循环中进行代谢[24],从而通过降低乙酸质量浓度来减弱其毒性作用[25]。大肠杆菌代谢乙酸的过程中通过乙醛酸途径的碳通量较小,导致细胞生长较慢,当乙酸被消耗完全时,细胞则以葡萄糖为唯一碳源进行代谢并迅速恢复生长[26]。

谷氨酸棒状杆菌在发酵工业中主要用于氨基酸的生产,如谷氨酸与赖氨酸[27]。乙酸能够对谷氨酸棒状杆菌产生一定毒性,虽然目前对乙酸抑制谷氨酸棒状杆菌的机制研究较少,但其毒性机理可能与大肠杆菌类似。谷氨酸棒状杆菌可同时利用培养基中的多种碳源物质[28],因此在面对乙酸胁迫时,最主要的响应机制为分解代谢。Wendisch等[29比较了谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032以葡萄糖、乙酸为唯一碳源及以两者混合物为碳源时的生长情况,发现谷氨酸棒状杆菌虽然能够代谢乙酸,但比生长速率及生物量积累明显小于以葡萄糖作为唯一碳源时的情况,因此生长受到一定抑制。为了更深入的阐明问题,研究人员测定了谷氨酸棒状杆菌利用不同碳源时的代谢通量,并进行了核心碳代谢流分析(图1),与以葡萄糖为唯一碳源时相比,以乙酸为唯一碳源及以葡萄糖和乙酸为混合碳源生长时碳代谢流显示出完全不同的通量分布:乙酸的存在导致了较为明显的乙醛酸途径通量,并且在CO2固定途径中表现出了可逆的糖异生净通量,可提供糖酵解途径及磷酸戊糖途径中的前体物质。同时,磷酸烯醇式丙酮酸与丙酮酸的形成大幅度减少,丙酮酸脱氢酶复合体的活性也明显降低甚至丧失,这直接导致由葡萄糖氧化成乙酰辅酶A的碳的比例大大降低。TCA循环中的酶活性尽管显示出增加的趋势,但由于不同底物摄取时绝对通量具有较大差异性,因此TCA循环的绝对通量减小。总之,当谷氨酸棒状杆菌面对乙酸胁迫时,虽然会代谢乙酸而减弱其毒性作用,但是碳通量分布的变化会影响菌株的生长及物质代谢,从而对发酵过程造成一定的负面影响。

G6P—Glucose-6-phosphate(葡萄糖-6-磷酸);F6P—Fructose-6-phosphate(果糖-6-磷酸);G3P—Glyceraldehyde-3-phosphate(甘油醛-3-磷酸);P5P—Pentose-5-phosphates(戊糖-5-磷酸);E4P—Erythrose-4-phosphate(赤藓糖-4-磷酸);S7P—Sedoheptu-lose-7-phosphate(景天庚酮糖-7-磷酸);ICI—Isocitrate(异柠檬酸);αKG—2-oxoglutarate(2-酮戊二酸);SUC—Succinate(琥珀酸);MAL—Malate(苹果酸);OAA—Oxaloacetate(草酰乙酸)。图1 不同碳源时的代谢流通量分布Fig.1 Metabolic flux distributions of different carbon sources

2.2 乙酸扩散减小

限制乙酸通过扩散作用进入胞内是微生物响应及耐受乙酸的重要机制,主要包括改变细胞壁结构,降低孔隙率来减小乙酸的扩散速率、改变细胞膜组分来减少乙酸分子的吸收以及其他方面的机制来减少乙酸向胞内进行扩散。Simoes等[30]报道酿酒酵母在乙酸胁迫下,与细胞壁功能有关的蛋白被表达,结果为细胞壁结构发生改变,表现出多孔结构的减少,因此能够有效阻止乙酸进入细胞。同时,在乙酸胁迫下,膜组分中脂肪酸含量发生变化,如大肠杆菌O157∶H7随着培养基中pH降低,细胞质膜中棕榈酸含量显着增加,环脂肪酸含量降低[31],在大肠杆菌K-12中,乙酸质量浓度的增加会导致脂肪酸比例发生改变,如C16∶1脂肪酸转变为C18∶1脂肪酸[32],这些变化有助于调节膜的流动性,保护膜脂质免受乙酸诱导的氧自由基损伤,也能在一定程度上阻止乙酸进入细胞内部。此外,在酿酒酵母细胞膜中含有与乙酸转运有关的蛋白Fps1p,乙酸胁迫下Fps1p蛋白被磷酸化并发生内吞作用,因此减少了乙酸通过该蛋白而扩散进入细胞内部,从而降低了乙酸对细胞的毒害,这是微生物阻止乙酸向胞内扩散的另外一种机制[33]。

2.3 胞内酸化程度减弱

由于乙酸抑制微生物生长的主要原因是细胞内部酸化,因此微生物更为直接的响应机制是减弱胞内酸化程度,即将胞内的氢离子(H+)泵出胞外,从而减少细胞所受到的毒害作用。在乙酸存在情况下,酿酒酵母会上调细胞质膜中质子泵PM-H+-ATPase与液泡膜中质子泵V-ATPase的活性,质子泵能够在ATP水解作用下将氢离子泵出胞外或液泡腔中,从而减弱胞内酸化程度并使内部pH值维持在正常范围内[34-35]。大肠杆菌抵抗细胞内部酸化涉及多种机制,这里主要介绍其中的两种,一种机制为消除有危害的质子来增加胞内的pH,通过K+/H+反向转运蛋白的作用使质子交换钾离子或通过氨基酸脱羧作用来实现,如在乙酸胁迫下,大肠杆菌中谷氨酸脱羧酶GadA催化谷氨酸脱羧形成γ-氨基丁酸,该脱羧反应不仅消耗了胞内氢离子,也能够消耗谷氨酸阴离子,从而一定程度上减少乙酸胁迫下细胞膜电位的消散[36]。同理,赖氨酸与精氨酸的脱羧系统也与乙酸耐受性有关;2013年,Lu等[37]报道了另一种耐受有机弱酸的机制,在酸胁迫下,大肠杆菌能够通过该机制来调控胞内pH值,大致过程为将谷氨酰胺转化为谷氨酸,同时释放气态氨,从而中和氢离子。

2.4 醋酸根离子外运系统诱导

乙酸在胞内解离后释放氢离子的同时,也导致了醋酸根阴离子的积累。胞内醋酸根离子的大量存在增加了膜电位,不利于物质传递,因此会影响细胞正常生理功能[38]。因为醋酸根离子所带的电荷属性使其无法通过扩散作用而穿过细胞质膜,所以激活乙酸分解代谢是减少胞内醋酸根质量浓度的有效途径。研究人员发现:当醋酸根离子积累于胞内时,细胞会诱导转运系统将胞内的醋酸根转运至胞外,从而在一定程度上减小细胞内醋酸根离子所引起的不利影响。Nakano等[39]在大肠杆菌和醋酸菌中发现了分子量为60 kDa的膜蛋白,该蛋白被推断为ABC转运蛋白,可将胞内醋酸根离子转运至胞外,当研究人员通过表达该蛋白后发现醋酸菌能够在含有更高质量浓度乙酸的培养基中生长且其比生长速率有所增大。对于酿酒酵母,由于葡萄糖存在时乙酸的分解代谢过程被强烈抑制,因此细胞减少内部醋酸根离子积累的唯一途径为相关转运蛋白转运醋酸根至胞外,如在乙酸响应下,多药耐药转运蛋白MDR能够将胞内的醋酸根泵出胞外,从而有利于提高酿酒酵母对乙酸的耐受性[40]。

3 结 论

微生物对环境胁迫的响应与适应已经成为发酵工业的重要研究方向。在工业发酵过程中,乙酸是关键的制约因素,会严重影响微生物的生物量积累与目标生物产物合成。系统地研究乙酸毒性机理,并理解不同微生物体系下的乙酸耐受机制,对于工业生产菌株的构建和选育具有重要意义。随着微生物组学研究的深入发展,将从分子水平上进一步揭示微生物耐受乙酸的分子机制,并通过代谢工程与合成生物学策略,设计适合工业生产的优良菌株,从而打破乙酸所导致的生产瓶颈。