离子对液相色谱法检测烹调香料中非法掺杂的罂粟壳

睢超霞，陈蕾，徐娜

(河南医学高等专科学校 药学系 化学教研室，郑州 451191)

烹调香料是某些植物的种子、果实、根等组织，添加在食物中具有去腥、除膻、解腻、增香、提鲜等功能。罂粟壳俗称大烟壳，系罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳，内含吗啡、可待因、罂粟碱等多种生物碱。罂粟壳中的生物碱虽然含量较低，但长期食用会出现盗汗、乏力、犯困等症状，严重时可能对神经系统和消化系统造成损害[1]。近年来屡有不法商贩在烹调香料中掺杂罂粟壳，制成所谓的秘制配方售卖，作为调味品在火锅料、卤料和汤汁中使用，用于招揽生意，牟取暴利[2]。2009年国家食品药品监督管理局发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，严禁将罂粟壳作为食用添加剂。

罂粟壳研磨成粉末后掺入烹调香料，常规的形态鉴别法难以准确辨别是否违法添加。罂粟壳中富含罂粟碱、吗啡、可待因等生物碱成分，判断是否违禁使用罂粟壳可以通过测定罂粟壳中的生物碱来判断。目前，测定罂粟壳中生物碱的方法有光谱法、电化学分析法、免疫分析法和色谱法等[3]。与其他分析方法相比，色谱法采用先分离后测定技术，能够排除样品中其他杂质的干扰，是鉴别食品中是否违法添加罂粟壳的最佳方法。沈平等[4]采用气相色谱-质谱联用法，检测了罂粟壳提取物中罂粟碱、蒂巴因等生物碱组分。林黛琴等[5]采用液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法定量检测掺杂罂粟壳食品中多种生物碱的残留。色谱-质谱联用法具有分析效率高、选择性好、检测灵敏度高等优势，但是色谱-串联质谱仪价格昂贵，操作步骤复杂，对操作人员的要求较高，在基层实验室难以开展。罂粟碱是罂粟壳特有的标志性组分，在罂粟壳中含量较高，具有兴奋、镇痛等麻醉作用，通过测定罂粟碱的含量可初步鉴别烹调香料是否违法添加罂粟壳。本研究采用基层实验室最常用的液相色谱仪，以己烷磺酸钠为离子对试剂，通过优化色谱条件，建立灵敏可靠、快速准确的液相色谱方法来测定罂粟碱，该方法适用于烹调香料中违禁成分罂粟壳的筛查与鉴别，可供基层实验室参考借鉴，为预防和减少掺杂罂粟壳的烹调香料造成的健康危害提供了检测技术手段。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

盐酸罂粟碱对照品(定值100%)：中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)、己烷磺酸钠(>98.0%)：Merck公司；盐酸三乙胺(≥99%)：Sigma公司；其他试剂为优级纯或分析纯，实验用水符合国家标准GB/T 6682-2008的要求。

Alliance 2695高效液相色谱仪 Waters公司；TU-1901双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；CT15RE高速离心机 Hitachi公司。

1.2 色谱条件

Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相(A∶B为40∶60)：其中流动相A为0.02 mol/L戊烷磺酸钠水溶液(称取3.48 g的己烷磺酸钠，去离子水溶解后加入2.0 mL的三乙胺，磷酸调pH至3.5，0.45 μm滤膜过滤后去离子水定容到1000 mL)，流动相B为甲醇；色谱柱温度为30 ℃；检测波长为240 nm；进样体积为10 μL；流动相流速为1.0 mL/min。

1.3 标准溶液的配制

准确称取2.5 mg盐酸罂粟碱标准品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，制成100 μg/mL的罂粟碱对照品储备液。采用流动相将储备液稀释到0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 μg/mL，制成标准应用液。

1.4 样品处理方法

首先配制1000 mL甲醇-乙酸混合提取溶剂(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)。烹调香料样品经研磨后过3号筛，精密称取样品粉末2.0 g，置于50 mL棕色锥形瓶中，加入20 mL提取溶剂，室温浸泡24 h，超声波(功率250 W，频率40 kHz)提取30 min，5000 r/min离心10 min，将上清液用滤纸过滤后置于100 mL棕色容量瓶中，按上述步骤提取3次，合并上清液后将提取溶剂定容到刻度，微孔滤膜(0.45 μm)过滤后进行HPLC 分析。

2 结果与分析

2.1 罂粟碱的光谱性能

检测波长的选择影响液相色谱分析方法的灵敏度，现有文献检测罂粟碱采用的波长有253，210，240 nm等[6-8]。罂粟碱的吸收光谱和溶剂有关，本研究采用流动相配制50 μg/mL的罂粟碱溶液，在200～400 nm范围内扫描紫外光吸收，结果见图1。罂粟碱在200～340 nm之间有紫外吸收，最大特征紫外吸收波长为239 nm，罂粟碱在此波长下的检测灵敏度最高，是罂粟碱检测的最佳波长。

图1 罂粟碱的紫外吸收光谱图

2.2 流动相的选择

罂粟碱属于生物碱，在酸性溶液中质子化后以阳离子形式存在，具有较强的亲水性。当以纯水-甲醇(或乙腈)为流动相时，色谱峰出峰时间较早，同时罂粟碱的胺基与色谱柱固定相表面残存的硅醇基发生相互作用，吸附在色谱柱的固定相上，造成色谱峰拖尾现象。

通过在流动相中添加离子对试剂可以改善分离效果，己烷磺酸钠中的极性磺酸根阴离子基团与罂粟碱的胺基阳离子基团缔合形成中性分子，增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，增强其保留作用，改善分离效果。同时在流动相中加入0.2%的三乙胺作为峰形改进剂，三乙胺可与色谱柱固定相表面的残留硅醇基结合，一定程度上抑制了罂粟碱与硅醇基的吸附作用，起到改善峰形的作用。

不同流动相下罂粟碱的色谱流出曲线见图2。

图2 不同流动相条件下罂粟碱的色谱流出图

由图2可知，添加离子对试剂后，色谱峰的保留时间延长，色谱峰形的对称性有所改善，增加了色谱定性和定量结果的准确性。本实验的流动相采用二元等度法，流动相比例A∶B为40∶60，其中流动相A为离子对水溶液(0.02 mol/L己烷磺酸钠溶液，含0.1%三乙胺，磷酸调pH至3.5)，流动相B为甲醇。

2.3 校正曲线的建立

按照1.2部分设定的色谱参数进样罂粟碱对照品，色谱峰见图3。罂粟碱在6.75 min出峰，标准样品的峰形呈正态分布且对称性良好，基本无拖尾现象。标准系列测试结果表明，在0.05～5.0 μg/mL范围内，罂粟碱浓度和色谱峰面积呈线性关系，以峰面积对标准溶液的浓度作图并线性拟合工作曲线；回归方程为Y=39815X+472拟合时要求相关系数大于0.995。

图3 罂粟碱对照品、空白烹调香料样品和加标样品的色谱图

同时将建立的液相色谱方法应用于空白烹调香料样品和加标烹调香料样品的测试，色谱流出曲线见图3。由样品色谱图可知，加标样品中的罂粟碱与空白样中其他杂质成分得到了基线分离，分析方法专属性良好。色谱峰正态对称分布，与标准溶液的保留时间基本一致(偏差<2.0%)。将加标样品色谱峰高稀释到3倍样品空白噪声(S/N=3)，计算出方法的检出限为0.01 mg/L。

2.4 方法的验证

2.4.1 样品的提取

罂粟壳中生物碱常用的提取方法有索氏提取法[9]和超声波提取法[10]，索氏提取法属于加热回流萃取方法，优点是设备简单，缺点是耗时，需要的提取溶剂也较多，对中药材的提取效率较差。超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，提高有效成分的提取效率，通常在30 min即可获得最佳提取率，同时提取温度较低，对易水解或氧化的待测成分具有保护作用。

常用的罂粟壳中生物碱的提取溶剂有纯水、甲醇、乙醇和乙酸[11]，设计单因素实验考察各种溶剂的提取效率，固定浸泡时间为24 h，超声提取时间为1 h，考察各种提取溶剂的提取效率，结果发现采用甲醇和乙酸混合溶剂(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)的提取率最高。采用超声波提取仪和甲醇-乙酸混合溶剂提取烹调香料的生物碱，提取过程见1.4。

2.4.2 加标样品的检测

测定市售3种烹调香料中的罂粟碱，配制加标样品，测定样品中罂粟碱的加标回收率和检测精密度。烹调香料调味品中添加不同含量的罂粟壳，分别在3份烹调香料中加入1.0，2.0，5.0 mL的100 μg/mL罂粟碱储备液，样品中罂粟碱的加标量分别为100，200，500 μg，按照1.4部分所示提取样品中的罂粟碱，并将样品稀释到校正曲线的线性范围以内，液相色谱测试结果见表1。

表1 样品含量和加标回收测试

由表1可知，3种不同加标水平样品中罂粟碱的回收率为78.5%～91.2%，检测结果平行测定7次的精密度为0.9%～1.4%，精密度和加标回收率代表着分析方法的精密度和准确度，建立的离子对液相色谱法能够准确可靠地检测烹调香料中非法掺杂的罂粟壳。

3 结论

近年来，在火锅底料、卤制品中添加罂粟壳得到了关注，目前还没有罂粟壳在食品中违法添加的国家标准检测方法，上海市食品药品监督管理局发布了食品安全地方标准(DB31/2010-2012)[12]，该标准采用液相色谱-串联质谱同位素内标法测定了罂粟碱、吗啡等罂粟壳中含有的生物碱，适用于火锅中非法添加罂粟壳的鉴定，缺点是仪器价格昂贵，基层实验室无法普及。罂粟壳粉掺杂在烹调香料中制作秘制配方的危害面严重，需要建立相应的简单快速的检测方法。高效液相色谱仪在基层较为普及，仪器易于操作，检测过程方便快速。本实验建立了离子对液相色谱法检测罂粟壳中的标志性成分罂粟碱，选用己烷磺酸钠作为离子对试剂，增强了罂粟碱的保留，同时加入三乙胺作为峰形改进剂，减少了色谱峰的拖尾。本方法操作简单，检测灵敏度高，且精密度和重复性均较好，有利于推广应用。