枯草杆菌二联活菌颗粒对稚鲵生长及免疫指标的影响试验

文/周韶辉 解宜兴 周先文 王晓清2, 陈家法

随机选取体质健康、体重为3g左右刚开口的稚鲵，每天分别以0.05%、0.10%、0.20%枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液进行拌料投喂试验，测定各组大鲵的生长及摄食指标、血液生理生化指标与血清抗氧化酶及非特异性免疫指标，结果表明以0.10%、0.20%枯草杆菌二联活菌颗粒溶水拌料投喂稚鲵，不仅能提升稚鲵的营养水平及生长性能，还能促进其抗氧化酶及非特异性免疫活性的提升，降低其肝功能损伤的风险，从而有效提升稚鲵疾病抵抗能力及存活率。

一、材料与方法

（一）试验地点

试验地点在湖南省大鲵救护中心，该中心是全国最早、规模最大的大鲵救护机构，也是湖南乃至全国大鲵种质保存最为纯正和最全面的基因库。

（二）试验时间

2019年01月～2019年06月，试验期共计180天。

（三）试验材料

枯草杆菌二联活菌颗粒为北京一公司生产，为复方制剂，配方组成见表1。试验用大鲵由湖南省大鲵救护中心提供，为规格3g左右的稚鲵。

（四）试验内容

根据前期预试验结果，设计单因素试验考察以不同添加量枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂，对稚鲵生长指标及非特异性免疫指标的影响。

1. 试验大鲵的选择与分组

随机选取48尾刚开口的稚鲵，30日龄、体质健康、体重为3g左右。分为对照组、枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组设3个重复，每个重复4尾大鲵。对照组：每天投喂基础饵料；低剂量组：每天投喂0.05%枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液拌料；中剂量组：每天投喂0.10%枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液拌料；高剂量组：每天投喂0.20%枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液拌料。

表1 枯草杆菌二联活菌颗粒配方组成

2.试验饵料组成

根据稚鲵阶段生长需要，基础饵料配方为100%红虫。

3.生长及摄食指标的测定

试验期间，记录试验大鲵的初始体重及试验结束时的体重、每日投饵量及残饵量，计算试验期内大鲵体重增加量、平均增重率、饵料系数、特定生长率。具体计算公式如下：

体重增加量=W2-W1；

平均增重率=[（W2-W1）/W1]/n×100%；

饵料系数=（F1-F2）/（W2-W1）；

特定生长率=（lnW2-lnW1）/t×100%

公式中，W1为大鲵的初始总重、W2为试验结束时大鲵的总重，n为各个重复的样本数，F1为总投饵量、F2为总残饵量，t为实验总天数。

4.血液生理指标测定

试验结束时，对所有试验大鲵以无菌注射器进行尾静脉采血，并将血样注入到添加抗凝剂的采血管中，将血样低温保存，送至湖南张家界市人民医院实验室以全自动生化仪进行检测，主要测定白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白（Hb）及血小板总数（Plt）等血液生理指标。

5.血液生化指标的测定

试验结束时，对所有试验大鲵以无菌注射器进行尾静脉采血，并将血样注入到添加抗凝剂的采血管中，将血样低温保存，送至湖南张家界市人民医院以全自动生化仪进行检测，主要测定总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL-K）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）等血液生化指标。

6.血清抗氧化酶和非特异性免疫指标测定

试验结束时，对所有试验大鲵以无菌注射器进行尾静脉采血，采集到的血液于4℃静置2h后，再以4000r/min离心10min，取上清液，即为血清。分别以试剂盒测定血清的酸性磷酸酶（ACP）、过氧化氢酶（CAT）及SOD（超氧化物歧化酶）等为抗氧化酶和非特异性免疫指标。具体方法如下：

（1）ACP的测定采用酸性磷酸酶试剂盒，其活力单位定义为：100mL血清或1g组织蛋白在37℃与基质作用30min产生1mg酚为一个金氏单位；

（2）CAT的测定采用过氧化氢酶测定试剂盒，其活力单位定义为：1mL或1mg组织每秒钟分解1μmol的H2O2的量为一个活力单位；

（3）SOD的测定采用总SOD试剂盒，以血清为样品，活力单位定义为1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量。

7.发病率及成活率统计

试验期间密切观察各组大鲵的生长情况，如发生病害感染应及时采取隔离措施，并对病鲵进行疾病诊断及治疗。试验结束时，统计各组大鲵各类病害发生情况、死亡数，计算发病率、死亡率及成活率。具体计算公式如下：

发病率= 发病尾数/ 总尾数×100%；

死亡率= 死亡尾数/ 总尾数×100%；

成活率=成活尾数/总尾数×100%

（五）饲养管理

将试验大鲵养殖于阴凉避光处，养殖水源为宝峰湖湖水，水温保持在20℃～25℃之间，溶解氧＞6.0mg/L，pH值为6.5～7.5。饵料经消毒后于每日18:00投喂，次日08:00捞出残饵，分别记录每日各组的投饵量与残饵量。

（六）统计分析方法

试验数据用Excel软件处理后，用SPSS13.0进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

二、结果与分析

（一）枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵生长性能的影响

由统计分析可知（表2），试验结束时，三个试验组稚鲵终末体重、平均增重率、特定生长率均显著高于对照组（P＜0.05），说明枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵的生长具有积极促进作用；高剂量组终末体重、平均增长率、特定生长率显著高于中、低剂量组（P＜0.05），说明该剂量的枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵生长性能具有更好地促进效果；三个试验组饵料系数均显著低于对照组。

（二）枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血液生理指标的影响

由统计分析可知（表3），试验结束时，对照组稚鲵血液白细胞数（WBC）显著高于三个试验组（P＜0.05），提示对照组稚鲵可能发生感染性疾病；对照组稚鲵血液红细胞数（RBC）及血红蛋白（Hb）显著低于三个试验组（P＜0.05）；对照组稚鲵血小板总数（Plt）极显著高于三个试验组（P＜0.01），提示对照组稚鲵全部或部分感染化脓性疾病。

（三）枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血液生化指标的影响

由统计分析可知（表4），试验结束时，三个试验组稚鲵血液中的总蛋白（TP）含量显著高于对照组（P＜0.05），但三个试验组间无显著性差异（P＞0.05）；三个试验组稚鲵血液中白蛋白（ALB）含量显著高于对照组（P＜0.05），且中剂量组及高剂量组稚鲵血液中白蛋白（ALB）含量显著高于低剂量组（P＜0.05）；三个试验组稚鲵血液中总胆红素（TBIL-K）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）含量均显著低于对照组（P＜0.05），但三个试验组间无显著性差异（P＞0.05）；四组稚鲵血液中甘油三酯（TG）及胆固醇（CHOL）含量均无显著性差异（P＞0.05）；三个试验组稚鲵血液中谷草转氨酶（AST）及碱性磷酸酶（ALP）含量均极显著低于对照组（P＜0.01）；三个试验组稚鲵血液中谷丙转氨酶（ALT）含量均显著低于对照组（P＜0.05）。

（四）枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血清抗氧化酶和非特异性免疫指标的影响

由统计分析可知（表5），试验结束时，中剂量组及高剂量组稚鲵血清中酸性磷酸酶（ACP）均显著高于低剂量及对照组（P＜0.05）；三个试验组稚鲵血清中过氧化氢酶（CAT）均显著高于对照组；中剂量组及高剂量组稚鲵血清中超氧化物歧化酶（SOD）均显著高于低剂量组及对照组。

表2 枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵生长性能的影响

表3 枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血液生理指标的影响

表4 枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血液生化指标的影响

表5 枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵血清抗氧化酶和非特异性免疫指标的影响

表6 枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵发病率及成活率的影响

（五）枯草杆菌二联活菌颗粒拌料投喂对稚鲵发病率及成活率的影响

由统计分析可知（表6），试验结束时，对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组稚鲵成活率分别为83.33%、91.66%、100.00%、100.00%；对照组发病率为16.67%，中剂量组及高剂量组发病率均为0；低剂量组死亡率为8.34%，但解剖后尚未发现明显疾病症状，体质健康、精子卵子质量好的亲本产生的后代个体健康，抗病力强，成活率高，否则体质弱，易发病，因此推测死因可能与遗传因素有关。经诊断，对照组患病稚鲵所患疾病均为腹水病。

三、讨论

稚鲵为大鲵变态发育过程中由受精卵孵化出膜，从利用卵黄作为营养到开口主动摄食阶段的大鲵。本阶段大鲵体弱性娇，抗逆性差，养殖过程中极易发生病害感染，从而导致其生长停滞甚至死亡。

枯草杆菌二联活菌颗粒为复方制剂，其主要成分包括枯草杆菌、屎肠球菌、维生素C、氧化锌等。临床研究表明，本品可直接补充正常生理菌丛，抑制致病菌，促进营养物质的消化、吸收，抑制肠源性毒素的产生和吸收，从而达到调整肠道内菌群的目的。此外，本品还含有机体发育所必须的维生素及微量元素，可有效补充因消化不良或腹泻所致的维生素及微量元素缺乏。

本研究结果表明，每天以0.10%或0.20%枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液拌料投喂稚鲵，能降低稚鲵患病的风险，从而提升其生长性能及存活率；血液生化指标检测结果显示，以枯草杆菌二联活菌颗粒溶水拌料投喂稚鲵能显著提升其营养水平、降低其肝功能损伤风险；血清抗氧化酶和非特异性免疫指标检测结果显示，以枯草杆菌二联活菌颗粒溶水拌料投喂稚鲵能显著提升稚鲵抗氧化酶及非特异性免疫活性。

试验期间，对照组部分稚鲵出现食量下降、体重减轻、反应迟钝等症状，以手触摸其头、腹部有积水感，经诊断初步判定为腹水病。对病鲵采取隔离饲养并将原养殖池以1.00mg/L浓度的漂白粉进行消毒，使其口服恩诺沙星（剂量为每公斤大鲵100mg/天）进行治疗，效果不理想，病鲵病势发展迅速，于3日～5日内陆续死亡。对病鲵进行解剖后发现其腹腔积水严重，胃肠无内容物，消化道充血，肝组织中见大量炎性细胞浸润，确诊为腹水病。此外，试验期间低剂量组稚鲵出现死亡1例，该稚鲵死亡前未发现明显异样，经解剖亦未明确致死原因，推测可能与遗传因素有关。稚鲵普遍体弱性娇，抗逆性差，养殖过程中极易发生病害感染，从而导致其生长停滞甚至死亡。本试验对照组与试验组发病率、成活率的差异反映出枯草杆菌二联活菌颗粒溶水拌料投喂稚鲵能有效提升其疾病抗性。

四、结论

综上所述，研究证明以0.10%、0.20%的枯草杆菌二联活菌颗粒水溶液拌料投喂稚鲵，不仅能提升稚鲵的营养水平及生长性能、还能促进其抗氧化酶及非特异性免疫活性的提升，降低其肝功能损伤的风险，从而有效提升其疾病抵抗能力及存活率。但目前关于枯草杆菌二联活菌颗粒用于水产养殖的研究仍鲜见报道，其作用机理、使用量及给药方式还有待进一步研究。