3.0T动态增强MRI定量灌注直方图参数与肺癌AKT/mTOR信号通路的相关性

张冰倩，赵振华*，黄亚男，毛海佳，邹明月，王诚，喻光懋，张敏鸣

1.浙江大学医学院绍兴医院（绍兴市人民医院）放射科，浙江绍兴 312000；2.浙江大学医学院绍兴医院（绍兴市人民医院）病理科，浙江绍兴 312000；3.浙江大学医学院绍兴医院（绍兴市人民医院）心胸外科，浙江绍兴 312000；4.浙江大学附属第二医院放射科，浙江杭州 310009； *通讯作者 赵振华 zhao2075@163.com

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康和生命[1-2]。近年来，肺癌的治疗已经从放化疗发展到基于分子基因、靶向免疫等的个性化治疗。蛋白激酶B（proteinkinase B，AKT）/磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是细胞内一条重要的信号转导通路，磷酸化AKT（p-AKT）是AKT 的活化状态，参与调控细胞的生存、增殖和分化等功能[3]。mTOR 是p-AKT 的直接下游信号分子，参与调节细胞的生长发育、迁移侵袭。在肿瘤进展中p-AKT、mTOR 表达异常升高[4-5]。AKT、mTOR 作为新的免疫治疗靶点，相关的靶向药物（如MK-2206、雷帕霉素等）越来越有希望运用于肺癌的治疗[6]。目前，检测p-AKT、mTOR的方法主要依靠对肿瘤组织侵入性的穿刺取样，由于组织标本仅能反映局部的组织情况而不能反映整个肿瘤组织情况，尤其肿瘤较大时，往往生长不均质，局部标本容易产生误差。本研究拟通过动态增强MRI（DCE-MRI）定量灌注直方图参数与肺癌组织p-AKT、mTOR 表达的相关性，探讨对病灶的分子病理信息进行无创性、可重复性预测的可行性，为临床选择治疗方案提供重要信息。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性收集绍兴市人民医院2017年1月—2018年4月经肺部活检穿刺或术后病理证实的肺癌33例，年龄50～85岁，平均（67±9）岁，其中鳞癌15例，腺癌12例，小细胞肺癌6例。纳入标准：①肺部病灶直径>2 cm；②MRI 检查前未接受穿刺、手术、放化疗、药物治疗等；③手术或穿刺活检后经病理确诊为肺癌；排除标准：①手术或穿刺与MRI 检查间隔3个月以上；②图像扫描质量不佳或肿块边界不明确。本研究经医院伦理委员会批准（批准号202063）。

1.2 MRI 检查 采用Siemens Verio 3.0T MRI 扫描仪，体部表面相控阵线圈扫描。先行常规平扫，于动态增强扫描前进行多翻转角扫描，扫描参数：TE 1.17 ms，TR 3.25 ms，翻转角5°、10°、15°，矩阵162×288，视野350 mm×282 mm，层厚5 mm，层数30，每期时间分辨率为6.5 s。动态增强扫描：翻转角10°，扫描35个时相，其余参数同上。DCE 扫描至第3 时相时经肘正中静脉高压注射钆双胺对比剂（欧乃影），剂量0.1 mmol/kg，速度3 ml/s，然后用20 ml 生理盐水以相同速度冲管。将翻转角与DCE 扫描序列导入Omni.Kinetics 软件，使用3D 非刚性校正技术对呼吸运动伪影进行校正（图1）。

图1 3D 非刚性校正技术对肺癌患者DCE-MRI 扫描图像呼吸运动伪影进行校正。配准前的肺动脉时间-浓度曲线（绿线）与胸主动脉时间-浓度曲线（蓝线）拟合较差（A）；配准后，肺动脉与胸主动脉期相-浓度曲线拟合改善，曲线更光滑（B）

1.3 图像后处理 选用肺动脉与支气管动脉双血供动脉输入函数类型进行图像后处理，并测量数据。选择肿瘤最大层面上下3～5个层面勾画病灶感兴趣区（ROI），避开囊变、坏死、周围血管区以及正常肺组织，整合成1个3D ROI 进行定量分析。最终获得转移常数（Ktrans）、血浆容积分数（Vp）、速率常数（Kep）、血管外细胞外间隙容积分数（Ve）的直方图参数（均值、偏度、峰度、均一性、能量、熵、百分位数）。由2名高年资放射科医师进行数据处理，测量3 次并取平均值。

1.4 p-AKT、mTOR 蛋白表达检测及结果判定 手术切除或穿刺活检标本常规石蜡包埋、切片、脱水，采用免疫组化分数测定染色结果[7]。免疫组化分数=染色强度分级×染色细胞百分数。染色细胞百分数：无染色计0分，染色细胞 ≤10%计1分， 11%～50%计2分， 51%～80%计3分，染色细胞 ≥81%计4分；染色强度：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3 分。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件，分类变量比较采用Fisher 确切概率法。使用Shapiro-Wilk 检验对计量资料进行正态性检验，正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法；非正态分布的计量资料用M（Q1，Q3）表示，多组间比较采用Kruskal-Walls 检验，多组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验。用Spearman 检验分析p-AKT、mTOR 表达与各DCE-MRI定量灌注直方图参数之间的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 不同病理亚型肺癌患者性别、年龄、体重指数及肿瘤最大径组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 33例不同病理亚型肺癌患者一般资料比较

2.2 不同病理亚型肺癌灌注直方图参数比较及p-AKT、mTOR 表达的差异 各灌注参数Ktrans、Kep、Ve、Vp直方图参数在不同病理亚型组间差异均无统计学意义（P>0.05）。p-AKT、mTOR 在3 组不同病理亚型肺癌中表达差异有统计学意义（P=0.003，P=0.037）。腺癌中p-AKT、mTOR 表达显著高于鳞癌（P=0.014、P=0.001）（图2、3）。

图2 男，82岁，左上肺鳞癌。A 为肺癌病灶组织的p-AKT免疫组化染色图，免疫组化分数为1 分（×400）；B 为肺癌病灶组织的mTOR 免疫组化染色图，免疫组化分数为2 分（×400）

图3 不同病理亚型肺癌组织p-AKT 及mTOR 表达

2.3 不同病理亚型肺癌定量灌注直方图参数与p-AKT、mTOR 的相关性 Spearman 检验结果显示，小细胞癌组Kep（Q5、Q10）与p-AKT表达呈正相关（ρ=0.841，P=0.036），Kep（能量）与p-AKT表达呈负相关（ρ=-0.841，P=0.036）；鳞癌组Ktrans（Q5）（ρ=0.760，P=0.001）和小细胞癌组Vp（均值、Q75、Q90、Q95）（ρ=0.926，P=0.008）与mTOR 呈正相关；鳞癌组Ve（均值）与mTOR 呈负相关（ρ=-0.619，P=0.014）（图4、5）。

图4 女，63岁，病理诊断为右上肺小细胞癌。A.病灶Ktrans伪彩图；B.病灶Vp 伪彩图；C.Vp 直方图（均值=0.126、偏度=1.302、峰度=2.419、均一性=0.462、能量=0.009、熵=7.042）；D.Ktrans 直方图（均值=0.175、偏度=0.956、峰度=1.358、均一性=0.521、能量=0.008、熵=7.164）

图5 肺癌p-AKT、mTOR 与EC 模型灌注直方图参数Kep 能量及Ve 均值的相关性

3 讨论

目前肺癌的治疗方法仍以放化疗及手术为主。随着对肺癌研究的不断深入，发现AKT/mTOR 通路是肺癌治疗中的重要靶点之一[8]。既往研究表明，AKT/mTOR 靶向药物与临床化疗药物联用比单独用药能更有效地抑制肿瘤活性，延长肺癌患者的生存时间[9-11]。与穿刺等侵入性检查相比，DCE-MRI 是一项无创、可重复的检查方法，所得灌注参数Ktrans、Kep、Vp、Ve能反映肿瘤的血流灌注和血管通透性等微环境的改变[12]，有助于了解肿瘤分化及恶性程度。直方图分析用均值、偏度、峰度、能量、熵和百分位数较好地量化了肿瘤组织微循环状态，反映肿瘤内部异质性[13]。

本研究中，不同病理亚型肺癌中AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达存在差异，腺癌组mTOR 与p-AKT表达显著高于鳞癌，可能提示不同病理类型肺癌发展过程中AKT/mTOR信号通路激活不一致。Fumarola 等[14]研究发现AKT/mTOR信号通路异常激活在肺鳞癌中比在肺腺癌中更常见。然而，Oh 等[15]研究发现肺腺癌中p-AKT和mTOR 的表达较肺鳞癌更为频繁，与本研究结果一致。导致不同研究结果差异的原因可能与缺乏普遍接受的标准通过免疫组化评估这些蛋白的表达有关。

AKT/mTOR信号通路激活可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，还可以通过上调缺氧诱导因子、一氧化氮、COX-2 的表达促进肿瘤血管形成[16]。Kep是对比剂从血管外细胞外间隙回流到血管内的通过率，与血管壁通透性密切相关。本研究中鳞癌组Kep（Q5）、小细胞癌组Kep（Q5、Q10）随着活化的p-AKT和mTOR 增多而增大，提示此信号通路的激活促进新生血管形成，血管壁渗透性增加。然而Kep均值与p-AKT、mTOR 无明显相关，其可能原因是肺癌在发展过程中血供的复杂性及其生长不均匀性较正常组织高，使得百分位数等反映参数分布特征的变量较反映参数集中趋势的平均值更有助于反映肿瘤的异质性[17]。能量与熵值体现像素分布的均匀性，能量越小，熵值越大，图像亮度信息分布越不均匀[18]。小细胞癌组Kep（能量）与p-AKT 呈负相关，提示p-AKT表达增加促进肿瘤细胞增殖，肿瘤内部异质性增高，表现为Kep（能量）减小。

Vp可反映组织的血流灌注量，小细胞癌组Vp（均值、Q75、Q90、Q95）与mTOR 呈正相关，提示此信号通路下游信号分子的激活刺激了肿瘤的增殖与血管形成。以Vp（Q75、Q90、Q95）为代表的高百分位数与mTOR 呈正相关，而低百分位数无明显相关，可能原因是小细胞癌增殖速度快，易多发小片坏死，未坏死部分血供丰富，Vp值较大。Ve与血管外细胞外间隙大小有关。本研究发现，鳞癌组Ve（均值）与mTOR呈负相关，激活的mTOR 越多，肿瘤增殖越活跃，血管外细胞外间质空间愈发减小，则Ve值越小。

本研究的局限性：①样本量较小，特别是小细胞癌，有待今后扩大样本量和细化研究方案；②仅勾画了部分肿瘤最大层面作为ROI，可能在描述肿瘤空间异质性方面存在一些偏倚；③肺部进行DCEMRI 扫描呼吸运动伪影较为常见。然而，本研究使用三维非刚性校正技术减少运动伪影对研究的影响。

总之，DCE-MRI定量灌注参数直方图参数Kep（Q5、Q10、能量）、Ktrans（Q5）、Vp（均值、Q75、Q90、Q95）和Ve（均值）与肺癌p-AKT、mTOR 蛋白表达具有相关性，能间接评价肺癌组织AKT/mTOR信号通路基因激活状态，具有无创、客观、可量化、可重复性好的优势，对肺癌的诊断和AKT/mTOR 靶向药物的选择等有一定的指导意义。