外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性与妊娠期高血压疾病的关系

高英，王情，郭红，贺媛媛，张砚敏

1 宝鸡市人民医院，陕西宝鸡721000；2 西京医院；3 陕西省中医医院

妊娠期高血压疾病(HDCP)是妊娠期常见的并发症之一，其发病率为5.2%～8.2%[1]。HDCP不仅可导致妊娠期血管功能障碍，还可引起早产、胎儿宫内窘迫、胎儿生长发育受限等，严重威胁母婴安全。迄今为止，HDCP的发病机制仍不完全清楚，可能是环境因素和遗传因素共同作用的结果[2]。肾素—血管紧张素系统(RAS)是维持机体水电解质平衡、血压稳定的内分泌系统。血管紧张素转换酶(ACE)是RAS的关键酶，ACE基因第16内含子插入/缺失(I/D)多态性与原发性高血压的发生密切相关[3-4]。血管紧张素原(AGT)是RAS的重要组成部分，具有血压调节作用，该基因第2外显子M235T多态性可影响血液AGT水平，与高血压发病密切相关[5]。为了明确外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性与HDCP的关系，我们进行了如下研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年2月—2019年12月宝鸡市人民医院收治的HDCP患者200例(观察组)，年龄(29.35±5.12)岁。所有患者符合《妇产科学》(第8版)中关于HDCP的诊断标准[6]。纳入标准：①符合HDCP诊断标准；②汉族，本地长期居住；③单胎妊娠；④既往无高血压、糖尿病病史。排除标准：①合并妊娠期糖尿病、肾炎、肝内胆汁淤积等并发症者；②合并电解质紊乱者；③合并内分泌疾病、血液或免疫系统疾病者；④妊娠期服用ACE、AGT抑制剂或肾素抑制剂者。同期选择在宝鸡市人民医院孕检的健康孕妇200例(对照组)，年龄(28.91±5.42)岁。两组年龄具有可比性。本研究经宝鸡市人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.2 外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性检测 所有研究对象入组后，采集清晨空腹肘静脉血3 mL，置于含2% EDTA的抗凝管中。取标本100 μL，加入红细胞裂解液轻轻吹打混匀，冰浴裂解15 min，2 000 r/min离心3 min、离心半径12 cm，弃上清，加入5% Chelez-100 200 μL充分混匀，56 ℃孵育20 min，2 000 r/min离心2 min、离心半径12 cm，留取上清液，-20 ℃保存。取上清液60 μL，采用全自动核酸提取仪AU1001及其配套试剂提取DNA，经UV7500双光束紫外可见分光光度计鉴定，提取的DNA纯度、浓度和完整性合格，可用于后续实验。通过GenBank数据库查找ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性，由上海天昊生物科技有限公司利用Premier5.0软件设计引物。引物序列：ACE基因I/D上游引物5′-CCGATCTGGCAGAACCTC-3′，下游引物5′-GTGTTCCAGATCGTCTTC-3′；AGT基因M235T上游引物5′-GGTITGTGCAGGGCCTGGCTCT-3′，下游引物5′-AGGGTGCTGTCCACACCTGCTC-3′。按PCR扩增试剂盒说明配制反应体系。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。取上述PCR扩增产物10 μL，用限制性内切酶MboII在37 ℃恒温水浴锅中酶切3 h，然后用2%琼脂糖凝胶电泳分离30 min，溴化乙锭染色，SNaPshot基因分型技术分析ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性。

1.3 血清ACE、AGT检测 采集所有研究对象妊娠20～26周空腹肘静脉血10 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min、离心半径10 cm，取上层血清，-80 ℃保存。采用全自动酶标仪ELISA法检测血清ACE、AGT。ELISA试剂盒均购自北京科美东雅生物技术有限公司。

1.4 资料收集与分析 所有研究对象入组后，收集其临床资料，包括孕前体质量指数(BMI)、被动吸烟例数、高血压家族史、收缩压、舒张压、孕次、产次、TC、TG、肌酐(Cr)等。比较两组上述临床资料，将有统计学差异的临床资料以及外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性纳入多因素Logistic回归模型，分析影响HDCP发病的危险因素。

2 结果

2.1 两组外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性分布比较 两组ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。两组ACE基因I/D基因型分布和等位基因频率比较差异均有统计学意义(χ2分别为7.071、5.183，P均<0.05)，AGT基因M235T基因型分布和等位基因频率比较差异均有统计学意义(χ2分别为7.925、8.619，P均<0.05)。两组外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型分布和等位基因频率见表1、2。

表1 两组ACE基因I/D基因型分布和等位基因频率

表2 两组AGT基因M235T基因型分布和等位基因频率

2.2 HDCP患者外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平比较 见表3、4。

表3 HDCP患者外周血ACE基因I/D不同基因型者血清ACE、AGT水平比较

表4 HDCP患者外周血AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平比较

2.3 影响HDCP发病的危险因素分析 观察组孕前BMI(24.35±4.15)kg/m2，被动吸烟例数45例，有高血压家族史32例，收缩压(139.15±8.09)mmHg、舒张压(76.32±6.12)mmHg，孕次(3.25±1.52)次，产次(2.53±0.61)次，TC(3.95±0.42)mmol/L，TG(1.91±0.35)mmol/L，Cr(13.26±3.26)μmol/L；对照组孕前BMI(21.05±3.02)kg/m2，被动吸烟例数21例，有高血压家族史10例，收缩压(116.43±5.03)mmHg、舒张压(64.83±4.08)mmHg，孕次(3.29±1.53)次，产次(2.03±0.36)次，TC(3.91±0.31)mmol/L，TG(1.88±0.33)mmol/L，Cr(9.65±2.15)μmol/L。观察组孕前BMI、被动吸烟例数、有高血压家族史例数、收缩压、舒张压、产次、Cr均高于对照组(P均<0.05)，而两组孕次、TC、TG比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

以是否患有HDCP为因变量，以孕前BMI、被动吸烟、高血压家族史、收缩压、舒张压、产次、Cr及外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性为自变量，建立多因素Logistic回归模型。结果显示，孕前BMI、被动吸烟、产次、ACE基因I/D多态性、AGT基因M235T多态性是HDCP发病的危险因素(P均<0.01)，见表5。其中，外周血ACE基因I/D多态性中携带DD基因型孕妇罹患HDCP的风险是携带II基因型孕妇的1.324倍(95%CI：1.023～2.062，P<0.05)，外周血AGT基因M235T多态性中携带TT基因型孕妇罹患HDCP的风险是携带MM基因型孕妇的1.905倍(95%CI：1.705～2.398，P<0.05)。

表5 影响HDCP发病的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

HDCP是妊娠期严重并发症之一，以高血压、蛋白尿、水肿为主要临床表现。HDCP可导致胎儿宫内发育迟缓、胎儿宫内窘迫、早产等并发症，还能导致母体脑血管意外、脏器功能衰竭、休克甚至死亡[7]。HDCP是一种遗传异质性疾病，但其具体发病机制仍不完全清楚。因此，明确HDCP的候选基因对其防治具有重要意义。

RAS是人体内重要的体液调节系统之一，对心血管系统发育、心功能稳态、电解质平衡、血压调控等均具有重要作用。有研究报道，RAS基因多态性与HDCP患者血压、24 h压力负荷动态变化有着密切联系[8]。ACE、AGT作为RAS的重要组成部分，其基因多态性可能导致HDCP的发病风险升高。ACE是RAS的关键酶，可调节血管收缩和血管舒张，维持机体正常血压。ACE作用产物血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体是RAS作用于效应器的关键成分，可发挥介导血管收缩、水盐代谢、血管平滑肌增生等生理作用[9,10]。ACE基因定位于人染色体17q23，包括26个外显子和25个内含子，其第16内含子上有一个287 bp的I/D多态性位点，该位点多态性已被证实与原发性高血压、顽固性高血压发病以及运动训练降压效果等有关[11-12]。但ACE基因I/D多态性与HDCP关系的报道少见，且其结论存在一定争议性。AGT是RAS的一种限速底物，经肾素酶催化转变为血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)，AngⅠ再经ACE催化生成AngⅡ；AngⅡ通过调节血管收缩，增加醛固酮、去甲肾上腺素水平，促进血管平滑肌细胞增殖、巨噬细胞激活，从而导致动脉粥样硬化形成和高血压发生[13]。AGT基因定位于人染色体1q42-43，含5个外显子和4个内含子，编码血管紧张素前体多肽。AGT基因目前已发现50多个多态性位点，其中AGT基因2号外显子704核苷酸处胸腺嘧啶被胞嘧啶代替可导致235号氨基酸由蛋氨酸转变为苏氨酸，该位点多态性被认为与高血压的发病密切相关。有研究报道，AGT基因M235T多态性与心血管疾病、终末期肾病存在一定相关性[14]。ZITOUNI等[15]研究发现，AGT基因M235T多态性能够增加子痫前期的发病风险，并与子痫前期严重程度密切相关。但目前国内鲜有AGT基因M235T多态性与HDCP关系的报道。

本研究两组外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。观察组外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型分布和等位基因频率与对照组比较均有统计学差异，说明ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性可能增加HDCP的发病风险。有研究显示，ACE基因I/D多态性与全身动脉性高血压的发病风险增加显著相关[16]。本研究比较了HDCP患者外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T不同基因型者血清ACE、AGT水平差异，结果发现外周血ACE基因I/D DD基因型者血清ACE、AGT水平高于DI、II基因型者，外周血AGT基因M235T TT基因型者血清ACE、AGT水平高于MM、MT基因型者，说明ACE、AGT基因多态性可能影响外周血循环中ACE、AGT水平。进一步研究发现，ACE基因I/D多态性、AGT基因M235T多态性是HDCP发病的危险因素，其中外周血ACE基因I/D多态性中携带DD基因型孕妇罹患HDCP的风险是携带II基因型孕妇的1.324倍，外周血AGT基因M235T多态性中携带TT基因型孕妇罹患HDCP的风险是携带MM基因型孕妇的1.905倍。

综上所述，外周血ACE基因I/D、AGT基因M235T多态性与HDCP的发病有关，携带ACE基因I/D DD基因型、AGT基因M235T TT基因型孕妇HDCP的发病风险更高。