狮子气味对小尾寒羊行为节律及生理内分泌的影响

李敏，王慧，李富宽，侯艳艳，金一，吕慎金*

(1. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2. 临沂大学农林科学学院，山东 临沂 276000)

捕食者与猎物之间的协同进化一直是动物学家研究的热点[1-2]。在不断的生物进化中，猎物为了最大限度的提高个体的存活率，已进化出生理、行为和形态反应以应对不可预测或潜在的捕食风险[3-5]。有证据表明，猎物对捕食者的化学信号例如捕食者的皮肤、皮毛、尿液、粪便和相关腺体的分泌物等识别并表现出反捕食策略[6]，其对捕食者具有特殊的适应能力，能够识别、躲避和防御捕食者，这种反捕食者行为是被捕食者生存的基础[7]。牛和绵羊对天敌粪便的气味非常敏感，Pfister等[8]研究表明，绵羊和牛拒绝采食被郊狼、狐狸、美洲狮污染的饲料，但不会影响绵羊和牛接近料槽的行为，其中郊狼气味的刺激减少了牛和绵羊的采食时间。

捕食应激假说提出，与捕食者或气味线索直接接触，会导致猎物激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)，触发包括分泌儿茶酚胺和糖皮质激素在内的生理反应[9-10]。在猫鼬的研究中发现，动物体内糖皮质浓度与警惕行为之间存在正相关关系[11]。Boudreau等[12]发现自由放养的白靴兔暴露于捕食风险时，随着捕食风险的增加血液中皮质醇浓度明显增加。

以往研究较为关注小尾寒羊繁殖、生长等主要生产性状，但对小尾寒羊嗅觉行为的研究较少，特别是在被捕食风险下，其采食行为抉择及行为分配如何目前仍知之甚少。本文以小尾寒羊为研究对象，通过观察捕食者气味(雄性狮子气味)对其日常行为时间分配以及生理指标的影响，探明小尾寒羊通过气味权衡环境中捕食风险的能力，为揭示捕食者与猎物之间的协同进化机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

试验于2019年12月在临沂大学小尾寒羊实验场进行。选择体况相近，健康的4～6月龄小尾寒羊12只(公母各半)，小尾寒羊按每天每只2 kg全混合颗粒饲料分7:30和19:30进行投喂，自由采食和饮水。

1.2 试验设计

1.2.1 试验处理

试验共分3个处理，即空白对照(不加任何动物粪便，试验时仅在饲槽上方添加饲料)、非捕食气味(在食槽篦子下方放入雄性兔子粪便，上方放入饲料)、捕食者气味(在食槽篦子下方放入雄性狮子粪便，上方放入饲料)。

空白对照、非捕食者气味、捕食者气味分公母羊依次进行：首先进行空白对照试验，试验时间12 h,试验结束后，将羊只移回原始圈舍，对试验圈舍进行彻底清扫消毒等。7 d后再进行非捕食者气味处理，试验时间12 h,试验结束后，将羊只移回原始圈舍，对试验圈舍进行彻底的清扫消毒。7 d后再进行捕食者气味处理。试验设7 d适应期，将羊只移入试验圈舍，并将试验料槽放入圈舍，采用该料槽饲喂，自由饮水，此期间没有气味源刺激，以使羊只适应新的圈舍环境及试验料槽。试验开始前，对圈舍及气味源投掷设备进行除味及消毒处理。对试验用料槽进行清洗晾晒，以减轻圈舍及料槽内原有气味对试验羊只的干扰。对自制铝锅(气味源投掷设备)清洗干净，祛除异味。

1.2.2 气味源投掷设备

将4个带有篦子的同等大小铝锅放到自制锅架内，含有多孔的透气篦子将铝锅分成上下两层，篦子的直径为32 cm，篦子下层放置刺激气味，上层放置饲料。

1.2.3 气味源的采集与处理

试验用雄性成年狮子粪便采集于临沂市动植物园。于排便后10 min内，用封口袋收集新鲜粪便，-20 ℃冰箱保存待用。试验当天将粪便从冰箱中取出恒温水浴解冻。兔子粪便采集于临沂大学小尾寒羊实验场，粪便采集后的处理方法与狮子粪便处理方法相同，小尾寒羊对试验用粪样均为完全陌生。试验时将收集的气味源粪便均匀的涂抹在锅底。

1.3 血液采集与生化指标测定

在气味刺激结束后立即对受试小尾寒羊颈静脉采血4 mL于真空促凝采血管中，放入冰盒带回实验室，3 500 r/min离心10 min，取上层血清，并做好标记，于-20 ℃冰箱保存待测。

利用ELISA试剂盒(上海裕平生物科技有限公司)测定血清皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、儿茶酚胺(CA)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)含量。

1.4 行为观察

对小尾寒羊气味刺激期间日常行为进行录像存储并带回实验室，利用扫描取样法观察自放入气味源起之后的12 h的日常行为，每2 h为一个单位，扫描间隔为5 min。观察小尾寒羊日常行为谱见表1。

1.5 统计分析

利用Excel对各观察时间段内每只试验羊的同种行为数据以及血液生化指标数据进行整理，通过SPSS 26.0统计软件对试验数据进行统计分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组内不同时段小尾寒羊行为变化和组间相同时间内的各行为变化，以及组间血液生化指标差异。通过Origin 9.1 统计软件进行作图。数据用“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

表1 小尾寒羊日常行为谱

2 结果与分析

2.1 狮子气味刺激对小尾寒羊静立行为节律的影响

图1所示，在狮子气味刺激下，随着时间的变化小尾寒羊静立行为频次呈升高-降低-升高-降低趋势,并在狮子气味刺激后8～10 h最多，0～2 h最少且存在显著性差异(P<0.05)。在兔子气味刺激下，小尾寒羊静立行为频次呈先升高后下降趋势，刺激后2～4 h静立行为频次最多，0～2 h最少。空白对照处理的小尾寒羊静立行为频次呈缓慢升高趋势，并在10～12 h最多，0～2 h最少。

纵向来看，8～10 h，狮子气味刺激处理的小尾寒羊静立行为频次，显著高于兔子气味刺激和空白对照处理(P<0.05)。10～12 h，狮子气味和兔子气味刺激处理的小尾寒羊静立行为频次显著低于空白对照处理(P<0.05)。

图1 狮子气味刺激对小尾寒羊静立行为节律的影响

2.2 狮子气味刺激对小尾寒羊移动行为节律的影响

图2所示，在狮子气味和兔子气味刺激下，小尾寒羊移动行为频次均呈降低-升高-降低的波浪式变化，空白对照处理的小尾寒羊移动行为频次呈上升趋势，并在刺激后10～12 h其移动行为频次最多。

纵向比较，0～2 h，受狮子气味刺激的小尾寒羊移动行为频次显著高于受兔子气味刺激和空白对照处理(P<0.05)。0～8 h，小尾寒羊的移动行为频次明显高于空白对照，但无显著性差异。10～12 h，受狮子气味和兔子气味刺激的小尾寒羊的移动频次显著低于空白对照(P<0.05)。

图2 狮子气味刺激对小尾寒羊移动行为节律的影响

2.3 狮子气味刺激对小尾寒羊采食行为节律的影响

图3所示，在狮子气味和兔子气味刺激下，小尾寒羊采食行为频次呈先降低后升高的趋势，并在刺激后0～2 h采食行为频次最多，且显著高于6～8 h(P<0.05)。在兔子气味刺激下，小尾寒羊在0～2 h采食行为频次最多，且显著高于8～10 h(P<0.05)。空白对照处理的小尾寒羊采食行为频次在0～2 h发生最多，且显著高于之后的2～12 h(P<0.05)。

纵向比较，狮子气味刺激0～2 h的小尾寒羊采食行为频次显著低于兔子气味和空白对照处理，但在2～4 h，狮子气味刺激的小尾寒羊采食行为频次明显高于兔子气味和空白对照处理(P<0.05)。

2.4 狮子气味刺激下对小尾寒羊卧息行为节律影响

图4所示，在各气味处理中，小尾寒羊的卧息行为频次均呈先升高后降低的趋势，并在6～8 h升高最多，与0～2 h相比均有显著差异(P<0.05)。纵向比较，0～6 h在狮子气味刺激下小尾寒羊的卧息行为频次明显低于空白对照，且在2～4 h时间段存在显著差异(P<0.05)，在6～12 h，在狮子气味刺激下，小尾寒羊卧息行为频次明显高于空白对照处理，且在10～12 h时间段有显著差异(P<0.05)。

图3 狮子气味刺激对小尾寒羊采食行为节律的影响

图4 狮子气味刺激对小尾寒羊卧息行为节律的影响

2.5 狮子气味刺激对小尾寒羊探究行为节律影响

图5所示，在狮子气味刺激下小尾寒羊探究行为频次呈缓慢降低趋势，并在气味刺激后0～2 h最多，且显著高于刺激后其他(P<0.05)。在兔子气味刺激下小尾寒羊探究行为频次呈降低-升高-降低趋势，并在气味刺激后8～10 h最多。空白对照中小尾寒羊探究行为频次呈上升趋势并在刺激后10～12 h最多，与2～4 h相比有显著差异(P<0.05)。

纵向比较，0～2 h受狮子气味刺激的小尾寒羊探究行为频次显著高于兔子气味处理和空白对照处理(P<0.05)。10～12 h小尾寒羊探究行为频次显著低于空白对照。

图5 狮子气味刺激对小尾寒羊探究行为节律的影响

2.6 狮子气味刺激对小尾寒羊反刍行为节律影响

图6所示，在狮子气味刺激下小尾寒羊反刍行为频次呈升高-降低-升高趋势，并在狮子气味刺激后10～12 h反刍行为最多，且与0～2 h相比呈显著性差异(P<0.05)。在兔子气味刺激下，小尾寒羊反刍行为频次升高-降低-升高-降低的趋势，在兔子气味刺激后8～10 h反刍行为频次最多，且与0～2 h相比呈显著性差异(P<0.05)。空白对照处理的小尾寒羊反刍行为频次呈先升高再降低的趋势，并在2～4 h反刍行为频次最多，与0～2 h相比有显著差异(P<0.05)。

纵向比较，4～6 h受狮子气味刺激的小尾寒羊反刍行为频次显著低于空白对照，而在10～12 h显著高于空白对照(P<0.05)。

图6 狮子气味刺激对小尾寒羊反刍行为节律的影响

2.7 狮子气味刺激对小尾寒羊观望行为节律影响

图7所示，在狮子气味刺激和兔子气味刺激下，小尾寒羊观望行为频次呈升高-降低-升高-降低趋势，受狮子气味刺激后4～6 h小尾寒羊观望行为频次最多，2～4 h最少且存在显著差异(P<0.05)。兔子气味刺激后4～6 h小尾寒羊观望行为频次最多，0～2 h最少，且存在显著差异(P<0.05)。空白对照的小尾寒羊观望行为频次呈升高趋势，并在气味刺激后10～12 h观望行为最多，在6～8 h时间段最少，且存在显著差异(P<0.05)。

纵向比较，10～12 h，狮子气味刺激的小尾寒羊观望行为频次显著低于空白对照处理(P<0.05)。

图7 狮子气味刺激对小尾寒羊观望行为节律的影响

2.8 狮子气味刺激对小尾寒羊血液生化指标影响

由图8可知，除白蛋白外，在狮子气味刺激下小尾寒羊血液CORT、ACTH、CA、GLB浓度高于兔子气味和空白对照处理，但各处理间均无显著差异(P>0.05)。

图8 狮子气味刺激对小尾寒羊血液生化指标的影响

3 讨论

3.1 狮子气味对小尾寒羊日常行为的影响

在欧洲兔子对捕食者气味行为反应的研究中发现，当狐狸粪便存在时，兔子表现出明显的反捕食行为，采食行为减少，增加了回避和警惕行为以及在采食前进行了更多的嗅探行为[15]。当白尾鹿暴露于狼气味中时，白尾鹿的警戒行为增加，采食量减少[16]。Christensen等[17]发现当马暴露在狼和狮子气味中时，马的警惕性提高，采食行为减少，日常行为明显改变。当狼、狐狸、美洲狮的粪便被放在食槽附近时，绵羊和牛会减少采食量，警惕性显著增加，且绵羊会避免在被肉食动物粪便污染的地方进行卧息[18-19]。本试验中小尾寒羊在接触狮子粪便气味后，采食行为和卧息行为频次减少，探究、移动和观望行为频次增加，小尾寒羊表现出更多的防御性行为，这与之前的研究结果基本一致。

捕食风险的时间分配假说认为，猎物在无时无刻会出现捕食者的风险下，从事任何活动时所采取的反捕食行为存在一个时间序列的分配。Lima等[20]采用模型比较了高风险和低风险两种条件下动物反捕食的行为决策，发现在突然发生的或短暂的高捕食风险条件下,动物分配于反捕食行为的时间明显增加，用于采食等非防御性行为的时间明显减少，当风险降低时，再增加采食的非防御行为的分配时间[14]。本试验发现，狮子气味刺激后0～2 h小尾寒羊采食行为频次显著低于兔子气味和空白对照处理，而在此时段狮子气味刺激后，小尾寒羊移动行为频次和探究行为频次要显著高于兔子气味和空白对照处理，说明小尾寒羊在狮子气味刺激后的最初时段内，面对丰富的食物，并没有直接采食，而是探究和移动，且在狮子气味刺激后0～2 h探究行为频次最高，在此时段其处于高度警觉的状态，小尾寒羊在采食和捕食者之间权衡利弊。这和之前的研究结果相同，在突然暴露或者短暂的狮子气味刺激下，小尾寒羊行为效应相对强烈，分配于防御性行为时间显著增加。小尾寒羊的采食行为主要发生在饲喂后的2 h内，采食结束后大部分时间用于反刍，而狮子气味刺激后4～6 h，小尾寒羊反刍行为显著低于空白对照处理，在狮子气味刺激后10～12 h，小尾寒羊反刍行为显著高于空白对照。在狮子气味刺激后0～6 h，小尾寒羊的卧息行为明显低于空白对照处理，在狮子气味刺激后6～12 h，小尾寒羊卧息行为显著高于空白对照组。由此可见，小尾寒羊反刍行为时间发生了后移，说明小尾寒羊花费更多时间探究食物并尝试食物，而反刍时间后移并减少，并且随着时间的推移，狮子气味刺激的小尾寒羊的卧息行为频次增加。这与之前的研究结果相似，当小尾寒羊长期暴露于狮子气味中之后，随着其对环境的适应性增强或气味的减弱，其警戒性降低，分配于非防御性行为时间明显增加。

在本试验中，小尾寒羊的性别因素并未造成差异，因此我们没有对此进行详细的讨论和解释。本试验选用扫描动物取样法观察动物的行为，小尾寒羊的饮水、舔砖等小概率事件在本文不做讨论。

3.2 狮子气味对小尾寒羊血液生化指标的影响

有捕食者存在的风险下，猎物在机体内分泌应激反应刺激下激活HPA，导致促肾上腺皮质激素、皮质醇的分泌增加，与此同时，还会激活与HPA轴平行的交感神经-肾上腺髓质轴(sympathetic-adrenal medulla axis，SMA)，触发儿茶酚胺(去甲肾上腺素和肾上腺素)的释放量增加[21]。促肾上腺皮质激素具有重要的调节机体代谢，心血管，免疫和内环境稳态的作用，同时负反馈作用于机体对内部和外部刺激的反应。在被捕食风险下，皮质醇的分泌可使动物有效应对和表现出适当的反捕食行为[22-23]。在本试验中，小尾寒羊在狮子气味刺激后血清中CORT、ACTH、CA，GLB水平升高，说明狮子气味刺激在一定程度上激活了HPA轴和SMA轴。Blanchard等[24]曾发现，大鼠暴露于猫的粪便、肛门气味和尿液后的回避行为和物种典型防御行为频次，不如暴露于猫的皮毛或皮肤气味后的回避行为和物种典型防御行为频次高。Masini等[25]研究也发现了相似的结果，暴露于雪貂肛腺分泌物的大鼠血浆皮质醇水平不如暴露于雪貂毛发或皮肤的水平高，他们认为，毛发或皮肤的气味是一种更直接的危险。

4 结论

狮子气味刺激可影响小尾寒羊的日常行为和生理内分泌。狮子气味刺激最初阶段小尾寒羊防御性行为增加，且随着时间的推移，小尾寒羊警惕性下降防御性行为减少，非防御性行为增加。同时狮子气味刺激可在一定程度上激活小尾寒羊HPA轴和SMA轴，但作用并不显著。