蛞蝓多糖的提取优化及抗氧化活性研究

张祖湘，王亚凤，韦用琼，阳丙媛，李岳，何瑞杰，阮俊，黄永林*

（1. 桂林医学院，广西 桂林；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西 桂林；3. 广西久福生物科技有限公司，广西 南宁）

0 引言

蛞蝓（Agriolimax agrestis Linnaeus）属腹足类腹足纲蛞蝓科动物的统称，为有肺的软体动物，因其体表布满黏液，俗称“黏虫、鼻涕虫、蜒蚰、土蜗、附蜗”。蛞蝓作为一种传统中药，具有味咸寒，入肺、肝、大肠经，祛风定惊、清热解毒、破瘀通经等功用，主治中风 僻、筋脉拘挛、惊痫、喘息、喉痹、咽肿、痈肿、痰核、痔疮肿痛等症[1-3]。文献报道蛞蝓中含有多糖、氨基酸、甾醇类及其他成分[4-7]。现代药理学研究表明蛞蝓提取物能够抑制宫颈癌HeLa 细胞裸鼠移植瘤生长，还可抑制肺癌细胞端粒酶基因hTERT 和改变突变型P53 的表达[8-9]。同时蛞蝓冻干粉能明显延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，具止咳化痰平喘作用，并能明显的降低哮喘豚鼠肺组织嗜酸性粒细胞浸润，对支气管哮喘及慢性支气管炎有较好的治疗作用[10-13]。目前国内外对蛞蝓化学成分的研究较少，多糖成分抗氧化活性的研究也未涉及。本研究通过单因素及正交试验优化了蛞蝓多糖的提取工艺，并对其多糖成分进行了抗氧化活性研究，为蛞蝓药材的进一步研究与开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛞蝓样品2019年7月购于南宁市五塘镇，经李岳执业药师分别鉴定为蛞蝓，凭证样品存放于广西久福生物科技有限公司。实验样品分别经自然干燥粉碎后，过60 目筛；FA2204B 电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；800Y 多功能粉碎机（铂欧五金厂）；TD5A-WS 台式低速离心机；德国IKA C-MAG HS10 恒温磁力搅拌器。实验所用甲醇、无水乙醇、丙酮、氯仿及正丁醇均为AR，水为实验室自制蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 蛞蝓多糖的提取流程

取干燥的蛞蝓粉末，过60 目筛，加10 倍5% 甲醇浸泡12h 脱脂，4000r/min 离心15min。取残渣加8 倍体积蒸馏水置于恒温磁力搅拌器（60℃，2000rpm）浸提4h，加压抽滤除残渣。得到滤液加无水乙醇至最终浓度80%，室温下静置24h 沉淀多糖。4000r/min 离心15min，取沉淀加蒸馏水复溶后再次沉淀多糖，取沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤脱脂两次。沉淀加蒸馏水复溶，得到蛞蝓粗多糖溶液。采用sevage 法除蛋白，氯仿：正丁醇=5:1 与蛞蝓粗多糖溶液1:5 混合后，剧烈振摇20-30min，使蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物质而分离，4000r/min 离心15min 后置于分液漏斗中，取水层重复除蛋白4 次，即得除蛋白的多糖溶液。减压浓缩后冷冻干燥，得粗多糖。

1.2.2 提取单因素试验

每组单因素试验均取5g 预处理后的蛞蝓粉末，按1.2.1下方法提取，得到蛞蝓多糖，称重，计算提取率。单因素试验分 别 考 察 浸 提 时 间（2h、4h、6h、8h、10h）、浸 提 比（1:2、1:4、1:6、1:8、1:10）、醇沉浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、浸提温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）对蛞蝓多糖提取率的影响。

1.2.3 提取正交试验

根据单因素试验结果，以蛞蝓多糖提取率为考察指标，选取浸提时间、浸提比、醇沉浓度、浸提温度4 项为考察因素，根据每个考察因素在单因素试验中得到的最优条件，均选取3个水平，设计L9（34）正交试验，其因素水平表见表1。正交试验均取5g 蛞蝓药材粉末，按照正交设计的试验条件进行提取，试验结果见表2。

表1 因素水平表L9（34）

1.2.4 蛞蝓多糖的抗氧化活性

1.2.4.1 蛞蝓多糖对DPPH·的清除

参考文献[14]。用95% 乙醇配置0.2mg/mL 的DPPH·溶液，避光保存。 取不同浓度的样品溶液0.1mL，加入0.16mLDPPH·溶 液，用95% 乙 醇 定 容 到1mL，避 光 反 应30min，在517nm 处测定吸光度为A1；将样品溶液替换成95%乙醇，同样方法测得的吸光度为A0；取不同浓度样品溶液0.1mL，用95%乙醇定容到1mL，测定的吸光度为A2。同样浓度的VC 作阳性对照。DPPH·清除率/%=[ A0-（A1-A2）/A0]×100%。

1.2.4.2 蛞蝓多糖对羟基自由基的清除

参 考 文 献[15]。分 别 取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL 的多糖溶液0.15mL，分别加入0.1mL 9mmol/L 的水杨酸溶液、0.1mL 9mmol/L 的FeSO4溶液、1.05mL 蒸馏水，摇匀，使之混合充分，再加入0.1mL 8.8mmol/L 的H2O2，置于37 ℃恒温水浴锅中反应15min，于510nm 波长处测定其吸光度A1，用相同体积的蒸馏水代替H2O2按上述方法反应后测定吸光度A2，用相同体积蒸馏水代替多糖溶液反应后测定吸光度A0。同样浓度的VC 作阳性对照。羟自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100%。

1.2.4.3 总还原能力

参考文献[16]并稍加改进。分别取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL 的 多 糖 溶 液0.1mL，加 入0.2mL PH 值为7.4 的磷酸盐缓冲液和0.15mL 1%铁氰化钾溶液，摇匀，于50℃恒温水浴锅中加热30min，冷水快速冷却至室温，加入0.1mL 10% 三 氯 乙 酸，3000r/min 离 心10min，取 上 清 液0.125mL 再加入0.1%三氯化铁溶液0.025mL，混合摇匀，室温下静置10min，使充分反应，于700nm 处测定吸光度A1，以蒸馏水代替多糖溶液按上述处理作空白对照测得吸光度A0。用同样浓度Vc 溶液作阳性对照。总还原力=A1-A0。

2 结果与分析

2.1 提取单因素实验结果

黑蛞蝓多糖的浸提时间、浸提比、醇沉浓度、浸提温度对多糖提取率的影响的单因素试验结果见图1。

图1 浸提时间（A）、浸提比（B）、醇沉浓度（C）、浸提温度（D）对蛞蝓多糖提取率的影响

由图1A 可知，浸提时间对蛞蝓多糖的提取率影响不大，浸提时间为2-6h 时，蛞蝓多糖的提取率随时间增加而缓慢增加，6h 后降低。所以选择适宜的浸提时间是6h。

由图1B 可知，浸提比为1:2-1:4 时蛞蝓多糖的提取率明显增大。浸提比为1:6-1:10 时趋势平缓，提取率远不及1:4。所以选择适宜的浸提比是1:4。

由图1C 可知，醇沉浓度为70%时蛞蝓多糖的提取率最高，醇沉浓度80%-90%时略有浮动，但都不及70%。所以选择适宜的醇沉浓度是70%。

由图1D 可知，浸提温度在40-60℃时，蛞蝓多糖的提取率逐渐升高，60-80℃直线下降。所以选择适宜的浸提温度是60℃。

2.2 正交优化实验结果

正交试验结果见表2，从极差R 值可以看出，4 个因素对蛞蝓多糖的提取率均有影响，影响次序为C（醇沉浓度）＞D（浸提温度）＞A（浸提比）＞B（浸提时间）。蛞蝓多糖的最佳提取条件为：A1B3C3D3，即浸提比为1:4，浸提时间为8h，醇沉浓度为90%，浸提温度为80℃。在此最佳工艺下进行验证，蛞蝓多糖的提取率为（5.44±0.4）%，优于其他组合项，表明该提取工艺可作为蛞蝓多糖的最佳提取工艺。

2.3 蛞蝓多糖的抗氧化活性

2.3.1 蛞蝓多糖对DPPH·的清除作用

蛞蝓多糖清除DPPH·的测定结果见图2。从图2 可以看出，Vc 对DPPH·表现出较为优异的清除能力，蛞蝓多糖对DPPH·的清除能力同样随浓度增加而增大，但是其清除能力明显小于Vc。蛞蝓多糖清除DPPH·的IC50=14.20mg/mL。

2.3.2 蛞蝓多糖对羟基自由基的清除作用

蛞蝓多糖对羟基自由基的清除作用结果见图3。可以看出蛞蝓多糖对羟基自由基清除能力随样品浓度的增加而增大，但清除能力不及VC。蛞蝓多糖清除其羟自由基的IC50=7.86mg/mL。

表2 正交试验结果L9（34）

表3 正交试验方差分析

图2 蛞蝓多糖对DPPH·的清除能力

图3 蛞蝓多糖对羟基自由基清除能力

2.3.3 蛞蝓多糖的总还原能力

蛞蝓多糖的总还原能力测定结果见图4。吸光度越大，表明样品的总还原能力越强。由图4 可以看出蛞蝓多糖的还原能力随浓度的增加而增大，具有一定的还原能力，但其还原能力小于VC。

图4 蛞蝓多糖的总还原能力

3 结论

通过单因素及正交试验结果，得出蛞蝓多糖的最佳提取条件为：A1B3C3D3，即浸提比为1:4，浸提时间为8h，醇沉浓度为90%，浸提温度为80℃。在此最佳工艺下进行验证，蛞蝓多糖的提取率为（5.44±0.4）%，优于其他组合项，表明该提取工艺可作为蛞蝓多糖的最佳提取工艺。抗氧化实验表明，蛞蝓多糖对DPPH、羟基自由基的清除作用及对铁离子还原能力均随浓度增加而增大，具有一定的抗氧化能力。