云红梨1号HY5基因原核表达载体的构建、表达和纯化

苏俊 陈璐 马伟荣

摘要：HY5为调控光形态建成的转录因子，调控花青素的生物合成与累积。通过构建云红梨1号HY5基因的原核表达载体，旨在为研究HY5蛋白的生物功能奠定基础。将云红梨1号的HY5基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，并对其进行诱导表达，通过谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。结果表明，重组质粒pGEX-4T-1-PyHY5的酶切检测及测序结果均正确，表明重组质粒载体构建成功。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，用100 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在37 ℃、220 r/min条件下诱导3 h后收集诱导菌株，在BL21菌株中均有明显的目的条带，诱导表达后的融合蛋白大小约为43.90 ku;PyHY5蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达。通过研究成功构建了pGEX-4T-1-PyHY5原核表达载体，诱导表达并纯化出PyHY5融合蛋白为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

关键词：HY5基因;云红梨1号;原核表达载体;诱导表达;纯化

中图分类号： S661.201  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）20-0062-06

我国是梨生产大国，年产量超过世界总产量的60%[1]。梨的果皮有绿色、黄色、褐色、红色等多种颜色，其中红皮梨最受消费者的青睐[2]，选育优质红皮梨已经成为当前国内外的育种目标之一[3]。目前，云南红梨主要包括早熟早白蜜、中熟32号（又称美人酥）和中熟35号（又称满天红）、晚熟云红梨1号，其中云红梨1号是由云南省农业科学研究院从云南省砚山县的种质资源中选育而来的[4]，其果皮着色面积远远超过其他3种梨，达90%以上。由于云南红梨外观色泽鲜艳、内在品质优良，目前已在云南安宁、江川、德宏、丽江、保山等地大面积种植，产品远销澳大利亚、新西兰、泰国等，市场前景广阔，在国内现已引种到河南[5-7]、贵州[8]、安徽、山东、河北[9]、甘肃[10]等省。

HY5是光形态建成的正调控因子，是光调控植物发育的分子开关[11]。光诱导果皮着色的过程主要包括光作用于光受體、光受体通过某种途径作用于转录因子、转录因子调控花青素的生物合成和累积等。云南红梨果皮的果色着色，主要是矢车菊素-3-O-半乳糖苷在果皮中合成和累积的结果[12]，影响果皮着色的主要因素是光照[13]。本研究对笔者所在课题组前期获得的云红梨1号HY5基因的序列进行分析发现，HY5蛋白除了bZIP域外，无其他明显的结构域，说明由于缺乏潜在的转录激活域，使得HY5蛋白要与其他转录因子发生协同作用。pGEX-4T-1是一种可以高效表达插入的外源基因的融合蛋白表达载体，带有tac启动子，具有氨苄青霉素（Amp）抗性，能够克服转录和转录后水平对外源基因的表达可能造成的不利影响[14]。因此，pGEX-4T-1-PyHY5融合蛋白的成功诱导表达和纯化，为云红梨1号依光合成红色果皮以及PyHY5基因功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验材料 云红梨1号果实于2019年9月采自云南省安宁市清水河果园，采后于笔者所在实验室中进行试验。使用水果刀迅速削取云红梨1号的新鲜红色果皮，立即投入盛有液氮的保温桶中，之后于实验室-80 ℃冰箱内保存。大肠杆菌DH5α 感受态细胞及表达菌株Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞，均购自天根生化科技（北京）有限公司;原核表达载体pGEX-4T-1，购自GE Healthcare公司。

1.1.2 主要试剂  试验中所用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（DP209-03）及质粒小提试剂盒（DP103-02），购自天根生化科技（北京）有限公司;限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4 DNA连接酶，均购自TaKaRa公司;LB培养基，购自安琪公司;NI Crystarose FF，购自晶诚生物科技公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），购自Amresco公司。

3 L S1（裂解缓冲液）配方：150 mL 1 mol/L Tris （pH值为8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）。

3 L S2（洗涤缓冲液）配方： 150 mL 1 mol/L Tris （pH值为8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L EDTA。洗涤时取40 mL，加入2 mL 20%Triton X-100。

20 mL S3（洗脱缓冲液，现配现用）配方：1 mL 1 mol/L Tris （pH值为8.0）， 0.2 g 谷胱甘肽（GSH），用去离子水定容至20 mL。

1.1.3 主要仪器与设备  PTC-200 PCR仪、SiGMA 3k15 高速离心机、NANODROP 2000 紫外分光光度计、DYY-10C 型电泳槽和电泳仪，均购自北京六一仪器厂;SYNGENE G： BOX 凝胶成像系统仪，购自英国Syngene公司;TS-1 脱色摇床，购自上海圣科仪器设备有限公司;YLN-III 超强紫外透射仪，购自北京誉朗诺科技有限公司;超声破碎仪，购自南京先欧仪器制造有限公司;NGC Quest 10 蛋白纯化系统仪，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司（Bio-Rad）。

1.2 试验方法

1.2.1 云红梨1号HY5基因的克隆 根据已有的苹果MdHY5基因序列（登录号：AB710143.1），设计特异性引物（PyHY5-F：5′-ATGCAAGAGCAGGCG-3′;PyHY5-R：5′-TCAATCCGCATTTGCAC-3′）。以云红梨1号红色果皮cDNA为模板进行PCR 扩增，PCR 扩增的反应条件：98 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 个循环;72 ℃ 5 min。回收PCR 产物，加尾，连接到pGEX-4T-1 载体上，转化E. coli DH5α 感受态细胞，提取质粒，经PCR 检测和酶切鉴定后测序。

对于构建好的pGEX-4T-1-PyHY5， 挑选菌落进行PCR 鉴定，切取大小正确的条带后，用 PGEX-5（正向通用引物，序列为5′-GGGCTGGC AAGCCACGTTTGGTG-3′）进行测序检测。测序结果表明，序列中有包含双酶切位点（BamHⅠ和XhoⅠ）的PyHY5基因片段，大小为495 bp，且含有双酶切位点BamHⅠ（GGATCC）和XhoⅠ（CTCGAG），与预期的载体片段相符，说明pGEX-4T-1-PyHY5原核表达载体构建成功，详见图1。

2.2 pGEX-4T-1-PyHY5原核表达载体的表达

将含有重组质粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表达菌株BL21（DE3）在100 mmol/L IPTG、37 ℃、220 r/min的条件下进行诱导，3 h后收集诱导菌株。12%SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果见图2。根据生物信息学分析结果，推测PyHY5的蛋白质大小为17.9 ku，pGEX-4T-1载体上所带GST标签蛋白大小为26 ku，因此推测诱导表达出的融合

蛋白大小为43.90 ku。由图2可知，该融合蛋白在BL21表达菌株中均有明显表达，且目的蛋白大小与预测蛋白大小吻合，而未诱导重组质粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表达菌株BL21（DE3）在4390 ku处没有出现明显条带，证明pGEX-4T-1-PyHY5原核表达载体得到了成功表达。

2.3 pGEX-4T-1-PyHY5原核表达蛋白的可溶性鉴定

选取表达最好的诱导菌液，离心收菌、去除上清后加入600 μL PBS，混匀后，置于超声破碎离心管中离心，取出上清，向去除上清的沉淀中加入100 μL PBS，混匀，分析目的蛋白是否为可溶性表达。用12% SDS-PAGE 凝胶电泳进行鉴定，由图3可知，pGEX-4T-1-PyHY5原核表达蛋白经诱导后在约43.90 ku处出现了1条蛋白条带，在未经诱导的空白对照中没有出现此条带;同时，在菌液离心后得到的上清液及沉淀中，位置相近的地方也出现与诱导成功的菌液相同的蛋白条带，表明pGEX-4T-1-PyHY5原核表达蛋白在上清中也有表达，且可溶性较好。

2.4 pGEX-4T-1-PyHY5原核表达蛋白的纯化

收集400 mL大量表达菌体，加入100 mL S1溶液、1 mL 1 mol/L DTT和1 mL 100 mmol/L PMSF，混匀后超声破碎（6号探头，功率30%，超声2 s，停止2 s，持续10～20 min），直至菌液达澄清半透明状态，离心后收集上清，将商业化GST-琼脂糖珠加入含有1 mL ddH2O的柱中，待珠子沉淀后，对融合蛋白进行处理和纯化。如图4 所示，PyHY5 融合蛋白经过S1、S2、S3溶液和GST-琼脂糖珠处理、纯化后得到单一的目的条带，未出现杂带，该蛋白与大量表达后PyHY5融合蛋白的位置一致，与预期蛋白大小相符，蛋白浓度、纯度较高，共获得8 mL纯化蛋白，经测定，纯化蛋白的质量浓度为500 μg/mL。

3 讨论

光在植物生长发育过程中的意义重大，在調控植物光形态建成的过程中，红光、远红光、蓝光、UV-、UV-B等均会影响HY5的积累，而且HY5调控光信号转导下游的相关基因[15]。目前，在部分植物（如津田芜菁[16]、拟南芥[17]、油菜[18]等）中，HY5的编码基因已经被成功克隆，HY5可直接与花青素合成的关键基因发生相互作用。在前人研究的植物中，HY5基因编码的HY5蛋白的C末端具有bZIP结构域，可直接与基因的启动子作用元件 G-box 结合，从而激活并诱导该基因的表达[11]。Ang等的研究表明，拟南芥的HY5过量表达植株在光下生长时，表现为光形态建成[19]，表明HY5是光形态建成过程中的1个正调控因子。尽管有学者对植物中的HY5进行了一些研究，关于HY5的结构、功能及其分子机制也逐渐明晰，但HY5与其他蛋白的协同作用尚未明确。因此，开展云红梨1号HY5基因的原核表达研究，可以为深入研究HY5的生物学活性和互作奠定基础。

大肠杆菌原核表达系统制备重组蛋白有诸多优点，目前已被广泛应用于植物蛋白的表达研究中[20]。将目标基因转移到带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的原核表达载体pGEX-4T-1上，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷后，tac就会被诱导，tac启动子后的GST标签及其后的插入基因就会得到表达[21]。而pGEX-4T-1载体表达的蛋白产物在N端含有GST序列，加入融合标签GST后，重组蛋白的大小会随即增加26.0 ku，蛋白正确折叠，以融合形式表达[14]。在本研究中，PyHY5的蛋白质大小仅为17.90 ku，因此表达的融合蛋白分子量应为43.90 ku;此外，由于pGEX-4T-1在表达菌株中高效表达，因此本试验以 pGEX-4T-1作为表达载体。构建原核表达载体后，在特定条件下被诱导，收集诱导菌株，发现有明显的目的条带，蛋白大小为43.90 ku，表明PyHY5蛋白在BL21菌株中高效表达。综上本研究以pGEX-4T-1作为表达载体，与云红梨1号PyHY5基因的开放阅读框构建重组质粒，转化表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态，获得了阳性的原核表达菌株。同时，用IPTG诱导原核表达载体pGEX-4T-1-PyHY5后，PyHY5蛋白获得了高效表达，这也为进一步阐明HY5调控花青素生物合成的分子机制奠定了理论基础。

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