微流控芯片测定癌胚抗原综合性实验设计

高志刚，潘 悦，罗 勇，宋其玲，王世盛，汪 晴

（大连理工大学 国家级化工综合实验教学示范中心，辽宁 大连 116024）

近年来，随着生命科学和信息科学的发展，现代科学仪器将成为今后发展的战略重点之一。分析仪器作为发展战略的重要组成部分，将面临新的机遇。与此同时，科学技术的不断更新与发展，使各个科研领域对仪器分析技术提出了更高的要求，如2020年的新冠病毒相关检测，其分析方法不仅要求准确、快速，同时还要尽可能降低测试成本，以满足大规模人群病毒筛查的需求。现代分析仪器和方法逐渐向信息化、自动化、微型化、便携化、智能化的方向发展[1-4]。

微流控芯片技术兴起于20世纪90年代，是在微米级通道结构中对微升级至纳升级液体进行操控的技术，能够将多单元技术在微小可控平台上灵活地组合和规模集成，也被称为“建在芯片上的实验室”[5]。该技术围绕生命科学开展相关研究，在分析化学、生物化学、生物医学器件等相关领域中发挥重要作用，同时也是化学、生物学、药学、微电子学、环境检测和微机械等一系列交叉学科的研究热点[6-9]。

基于科教结合背景，同时为提升制药工程专业实验教学质量和促进创新人才培养，我校微流控芯片研究团队总结多年的研究成果，以微流控芯片检测技术和免疫学分析为学习重点，设计实施了癌胚抗原测定综合性实验。通过本实验的学习，学生能够熟悉玻璃微流控芯片的设计及制作方法，掌握磁性纳米粒子的常规合成方法，以及紫外分光法和电镜法等表征方法；掌握免疫标记的修饰方法，并学习抗体与金纳米颗粒偶联方法；利用抗原-抗体特异性结合来测定肺癌标记物-癌胚抗原在生物样本中的浓度，以此作为辅助诊断肺癌方法，提升学生对理论与实践、知识与技术的整合运用能力。

1 实验原理

拉曼光分析法基于拉曼散射效应，通过对散射光谱进行系统分析，获得分子振动、转动方面的信息。目前较认可的原理为散射光与入射光频率相同称为瑞利散射，与入射光频率不同称为拉曼散射，对称分布在瑞利线两侧的分别称为斯托克线（瑞利线低频一侧）和反斯托克线（瑞利线高频一侧）。激发光与此分子的作用引起的极化可以看作为虚的吸收，表述为电子跃迁到虚态，虚能级上的电子跃迁到下能级而发光[10]。

在通常情况下，拉曼散射效应非常弱，几乎都要利用某种增强效应来提高该方法的灵敏性，由此产生了表面增强拉曼散射（SERS）效应。它是在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中, 吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强的现象。其增强机理主要包括电化学增强和磁场增强等。随着 SERS技术的逐渐成熟，其在生物、医学、环境、农药残留和免疫学等领域的应用也越来越多[11-13]。

本实验中将 SERS与标记免疫学相结合，利用SERS灵敏度高的特性，以抗体-抗原的特异反应捕获生物样本中的癌胚抗原。实验原理如图1所示，所制备的免疫金溶胶和磁性抗体，能够与待测样品中抗原特异性结合，形成夹心免疫复合物，并通过其上的拉曼探针分子信号强度进行定量分析。同时还将磁性纳米粒子应用于免疫检测，其最大优势是在外加磁场作用下，样品能快速地富集，在短期内能得到浓缩和纯化，有助于提高检测效率、缩短检测时间[14]。磁性纳米粒子具有较高的比表面积，可以通过修饰提供足够多的表面结合位点来与抗体等生物分子结合，从而提高检测的灵敏度[15]。

图1 微流控芯片检测原理图

2 实验方法

2.1 芯片的制作

本实验选择光学玻璃作为芯片材料，玻璃材质具有良好的光学特性，经光刻和蚀刻等工艺可以得到三维微结构，且对生物大分子样品不存在潜在毒性。玻璃芯片的基片包括S-1805光刻胶（厚度570 nm）、铬保护层（厚度145 nm）、光学玻璃等，制作工艺包括掩膜的制作、曝光、显影、刻蚀、打孔、去保护层、清洗及表面活化、热键合等8个步骤。

2.2 免疫金溶胶的制备

经无水乙醇和去离子水超声清洗过的 1.5 mL离心管中，加入1 mL的35 nm Au，5 000 r/min速度离心约15 min（下同），弃上清液后加入1 mL硼砂缓冲液，然后加入6 μL的0.1 mmol/L的4,4′-联吡啶，在振荡器上混匀后摇床上温育10 min，取出后离心，弃上清液后加入1 mL硼砂缓冲液，用微量进样器取6.7 μL的2.7 mg/mL的CEA抗体，振荡器混匀后温育3.5 h，取出离心弃上清液后加入1 mL的硼砂缓冲液，再加10 μL的牛血清白蛋白（BSA）。混匀后温育1 h，取出离心弃上清液后，加入1 mL硼砂缓冲液，得到拉曼标记免疫金溶胶，放入冰箱保存待用。

2.3 Fe3O4@Au-抗体溶液的制备

2.3.1 Fe3O4的合成

由于实验中需要水溶性好、铁磁性高的磁性纳米粒子，故选择溶剂热法合成 Fe3O4磁性粒子。称取0.65 g的FeCl3和0.2 g的柠檬酸钠，加入20 mL的乙二醇（还原剂）超声震荡0.5 h后，在机械搅拌条件下缓慢加入1.2 g无水醋酸钠，待固体全部溶解后继续搅拌 3 h，后转移至四氟乙烯内衬的反应釜中，并在200 ℃下反应10 h。待其冷却至室温后，用去离水洗涤多次，最后分散在20 mL水溶液中待用。

2.3.2 Fe3O4氨基化修饰

取1 mL合成的Fe3O4水溶液，溶于50 mL无水乙醇中，超声分散5 min后加入110 μL的3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS），再超声15 min分散均匀。常温下机械搅拌12 h，停止后超声15 min，冷凝回流2 h。冷却至室温后，用无水乙醇磁分离洗涤8次除去溶液中未连接上的APTMS，最后分散在15 mL乙醇中备用。

2.3.3 Fe3O4@Au的合成

取45.5 mL超纯水于100 mL的广口瓶中，分别加入1.5 mL的0.2 mol/L氢氧化钠水溶液，1 mL四羟甲基氯化磷稀释液（1.2 mL稀释至100 mL的水溶液）。常温下磁力搅拌5 min后，逐滴缓慢加入2 mL的1%氯金酸溶液（1 g的四水合氯金酸溶于100 mL超纯水中），溶液逐渐由无色变为紫黑色。常温搅拌2 h后停止搅拌，放入冰箱待用。加入已经氨基化修饰的15 mL Fe3O4-乙醇溶液与25 mL的2 nm Au混合，超声并室温下机械搅拌 24 h，用水磁分离洗涤多次，得到Fe3O4-2 nm Au，并分散在15 mL超纯水中。

取上述制备的Fe3O4-2 nm Au溶液2 mL转入到盛有16 mL 1%的氯金酸溶液中，超声分散后，在机械搅拌下逐滴加入2 mL甲醛溶液，溶液逐渐变为蓝色，磁分离洗涤后分散在4 mL硼砂溶液中，得到Fe3O4@Au存入冰箱待用。

2.3.4 Fe3O4@Au与CEA抗体复合物的制备

在用乙醇和去离子水超声清洗过的4 mL离心管中取1 mL的Fe3O4@Au溶液，加入6.7 μL的CEA抗体，混匀后温育4 h，磁洗后弃上清液，加入1 mL硼砂缓冲液，以及10 μL的10%BSA，温育1 h后取出磁洗后弃上清液，加入1 mL硼砂缓冲液，放入冰箱待用。

2.4 SERS与标记免疫学的CEA检测

将制备好的1 mL磁性癌胚抗原抗体从芯片左侧进样口通过注射泵缓慢注入芯片内，将1 mL已经连接 4,4-联吡啶拉曼探针的免疫金从右侧进样口通过注射泵注入芯片内，1 mL的CEA抗原稀释液从中间进样口注入芯片内，3个注射泵流速设置为0.2 mL/h。1 h后，将超纯水从芯片中间进样口注入芯片内，清洗通道10 min后进行拉曼检测。

检测设备为激光共聚焦显微拉曼光谱仪，检测参数设置为激光波长633 nm，激光功率5 mW，10倍物镜，曝光时间1 s，积分次数20次。每次检测前，用硅片校正仪器参数。

3 实验结果与讨论

3.1 玻璃芯片的结构尺寸

实验中玻璃芯片制备所用的掩膜，均由FreeHand软件完成微通道结构的设计，掩膜尺寸63 mm×63 mm，通道尺寸500 μm×80 μm，长度为15 cm，按掩膜用光刻蚀与湿法刻蚀结合制备出的玻璃芯片如图2所示。在用聚二甲基硅氧烷（PDMS）材质制作的通道接口处固定3个长度相当的枪头，以便注射样品。S型通道是样品进行混沌混合的区域，经过 4个弯道的混合，样品之间充分接触和反应，反应后的溶液在流经固定有圆形小磁铁的集液槽时，磁性复合纳米粒子被外部磁场吸附而停留，剩余的溶液则经废液槽排出通道。

图2 玻璃芯片检测实物图

3.2 Fe3O4@Au粒子表征

合成的 Fe3O4磁性粒子水溶液呈棕黄色，粒子浓度范围为12～13 mg/mL，对其进行磁性考察。在装有粒子的带塞锥形瓶侧边放一块方形磁铁，粒子能很快被吸附到侧边且溶液澄清，说明所制备的粒子磁性能好，能被磁铁快速吸附而从溶液中分离出来。

图3是Fe3O4@Au粒子的紫外吸收光谱图，由图可知，Fe3O4粒子并没有特征吸收峰，而包裹了金壳之后，在578 nm处出现了特征吸收峰，与金粒子紫外光谱图相比，出现了红移现象。这是因为 Fe3O4@Au粒子形成之后，Au粒子中的电子发生转移，Au壳表面出现电子缺失，引起吸收峰红移。

图3 Fe3O4@Au紫外光谱图

Fe3O4@Au还利用透射电镜表征，如图 4所示，金包被完全的粒子，本实验采用种子生长法，是由已经连有2 nm Au的Fe3O4继续用甲醛缓慢还原出Au粒子，在机械搅拌下，还原出来的 Au粒子能比较均匀地在Fe3O4粒子表面生长。

图4 Fe3O4@Au透射电镜谱图

3.3 癌胚同抗原的SERS检测

3.3.1 拉曼探针特征峰表征

在免疫检测中为了使检测信号更加清晰，常需要在实验中加入标记分子，常用的拉曼探针标记分子有苯硫酚、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、4,4′-联吡啶等，苯硫酚是单官能团的标记分子，官能团和抗原或抗体将 Au溶胶混合连接；对巯基苯甲酸和对巯基苯胺是双官能团标记分子，巯基与 Au溶胶颗粒连接后，另外一个官能团能与抗原和抗体相连，增加了共轭效应；4,4′-联吡啶可以在金属表面促进特定分子的氧化反应，从而自组装成单分子层，它可以作为良好的标记分子，应用到SERS技术中。实验中选用4,4′-联吡啶作为标记分子，在 Au溶胶表面连接的 4,4′-联吡啶数量越多，则拉曼信号越强。拉曼信号特征谱图如图 5所示，确定3个特征峰，1 000 nm-1为不饱和碳氢的面内弯曲振动，1 299 nm-1为饱和碳氢的面内弯曲振动，1 617 nm-1为碳-碳键的伸缩振动。

图5 4,4ʹ-联吡啶拉曼信号特征谱图

3.3.2 拉曼探针加入量对信号的影响

考虑到标记分子的加入量与标记反应时间会对拉曼信号的强度造成影响，所以对标记分子的加入量与标记时间进行了优化。首先是标记分子的加入量优化，取6支1.5 mL离心管，分别加入1 mL的35 nm的Au溶胶离心，去除上清液后加入1 mL硼砂缓冲溶液，分别加入 1.5、3、4.5、6、7.5、9 μL的 0.1 mmol/L的4,4′-联吡啶反应10 min，离心去除上清液加入1 mL硼砂缓冲溶液，分别取200 μL进行拉曼信号强度检测得出，当4,4′-联吡啶的加入量为6 μL时，其拉曼信号强度最大，所以确定标记分子的加入量为6 μL。

3.3.3 标记反应时间对拉曼信号的影响

对标记反应时间T进行优化。取6支1.5 mL离心管，分别加入1 mL的35 nm Au溶胶，离心后去除上清液，分别加入 1 mL硼砂缓冲溶液和 6 μL的0.1 mmol/L 的 4,4′-联吡啶，分别反应 5、10、30、60、120 min后，然后离心去除上清液加入1 μL硼砂缓冲溶液，分别取200 μL进行拉曼信号强度检测，如图6所示，可以看出，反应时间在0～30 min内，拉曼信号的强度逐渐减弱，考虑到操作的简便性，故取标记反应时间为10 min。

图6 反应时间与拉曼强度关系

3.3.4 拉曼检测结果分析

实验中，依次配置 1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 µg/mL 和 10 µg/mL等不同癌胚抗原浓度样品，拉曼检测结果如图 7所示，可以发现，随着样品浓度的不断增加，特征峰强度也随之增加。选择1 617 nm-1信号强度，建立浓度与特征峰之间曲线关系，结果表明在样品浓度1 pg/mL至10 µg/mL浓度范围内，检测结果重复性较好。

图7 不同浓度下拉曼信号趋势图

4 结语

本综合性实验是由教师科研成果经总结提炼后转化而来，与传统制药工程专业实验相比，实验内容涵盖多学科知识，具有探究性和前瞻性。同时综合性实验的操作难度大、实验要求高、实验耗时长，因此在教学过程中要因地制宜结合学生情况开展，从而促进实验教学模式改革。此外，通过本实验的开展，扩展了微流控芯片技术以及纳米材料在免疫、生化等领域的应用。