热休克蛋白70在细胞凋亡途径中的作用研究进展

刘松松，项 阳，王 剑

（西南大学动物科技学院，重庆 400715）

细胞凋亡的概念被提出是用于描述形态学上不同的细胞死亡方式[1-2]。细胞凋亡是生命延续中不可缺少的环节，通常发生在生长、发育和衰老期间，细胞凋亡清除机体内受损和（或）多余代谢产物，有利于维持内环境的稳态，在胚胎发育、机体稳态和免疫系统调节中起主要作用。另外，细胞凋亡是由热应激、缺氧、DNA损伤或细胞毒性等诱导的程序性细胞死亡[3]。细胞凋亡是一个极其复杂的、精确调控的、蛋白酶及能量依赖的分子级联反应过程[4-6]。热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是原核生物和真核生物中一种高度保守蛋白，HSP70作为HSP家族普通的一员，其通过多种方式干扰凋亡机制防止细胞凋亡。

目前为止，研究证明存在多种凋亡途径，外在（死亡受体）途径和内在（线粒体）途径是主要的凋亡过程，均由半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族介导。2种途径的信号传导归功于Caspase-3水平，Caspase-3是一种效应Caspase，并且一条途径中促凋亡蛋白Bid分子可以影响另外一条途径[7]。另外，还有一种细胞凋亡途径是穿孔素/颗粒酶介导信号通路，由具有细胞毒性的T细胞介导对细胞有穿孔性的死亡途径，主要通过颗粒酶A或颗粒酶B导致细胞凋亡。除了以上几种凋亡途径，内质网和溶酶体在细胞凋亡中也起着重要决定作用，称之为内质网和溶酶体途径。内质网主要通过调节Bcl-2家族而引起的细胞凋亡，而溶酶体主要受到H2O2鞘氨醇的刺激产生抗凋亡蛋白组织蛋白酶（Cathepsin），从而抑制线粒体膜上Bcl家族表达。虽然这些导致凋亡途径不同，但最后都会由相同的凋亡执行者Caspase酶家族来完成凋亡。本文综述了HSP70对以上几种细胞凋亡途径的研究进展。

1 细胞凋亡的途径

1.1 内在途径 细胞凋亡的内在信号传导途径涉及多种非受体介导的刺激，直接作用于细胞内靶标的细胞内传导，主要以线粒体为主。线粒体途径既是多种促凋亡信号级联或损伤的传导者，又是机体代谢的协调者，最终导致细胞凋亡。当细胞受到各种刺激因子作用，如热应激、缺氧、DNA损伤等，会导致线粒体膜电位稳态被破坏、通透性增加，线粒体膜内的促凋亡因子释放到胞质，激活线粒体途径，引起细胞凋亡。这些蛋白主要是B细胞淋巴细胞白血病原癌基因2（B-cell lymphocyticleukaemia proto-oncogene 2，Bcl-2）和Bcl-2相关蛋白[7]。其中一种释放的膜间蛋白是细胞色素c（Cytochrome c，Cyt c），进入细胞质就会与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptotic Protease Activation Factor-1，Apaf-1）发生作用，从而触发Apaf-1的ATP依赖性寡聚化而暴露出Caspase募集结构域（Caspase Recruitment domain，CARD）[8]。最终活化的结构与前Caspase-9相互作用形成凋亡体，即Caspase-3激活复合物[9]。另外释放的蛋白质有黄素蛋白细胞凋亡诱导因子（Apoptosis Inducing Factor，AIF）、第二线粒体源性Caspase激活剂（Second Mitochondria Derived Activator of Caspase，Smac或DIABLO）和Htra2/Omi，这些蛋白将会抑制抑制凋亡蛋白（Inhibitory Apoptotic Proteins，IAPs）的活性[10-11]。Smac/DIABLO被认为是多种癌细胞中重要调节因子，这些因子的释放也能调节细胞凋亡。例如，Smac在氧化应激诱导的肌细胞（如C2C12肌源性细胞和心肌细胞）凋亡中起重要作用[12-13]。

1.2 外在途径 细胞凋亡的外在信号传导途径涉及跨膜受体介导的相互作用。外在途径是由死亡受体的肿瘤坏死因子（Tumour Necrosis Factor，TNF）受体家族的质膜蛋白触发并导致细胞凋亡。TNF家族的成员都具有一个相同的结构域，称为“死亡结构域（Death Domain，DD）”，DD包括的配体和受体有FasL/FasR、TNF-α/TNFR1、Apo3L/DR3、Apo2L/DR4和Apo2L/DR5[14-15]。DD的功能是将细胞外信号传到细胞内，DD与细胞溶质蛋白TNF受体死亡结构域蛋白（TNF Receptor Death Domain Protein，TRADD）或Fas相关死亡结构域蛋白（Fas Associated Death Domain Protein，FADD）的DD相互作用。配体和受体的结合导致衔接蛋白TRADD与FADD和RIP的募集结合[16]。最后FADD通过死亡效应结构域的二聚体与前体Caspase-8结合，形成死亡诱导信号复合物（DISC）并导致前体Caspase-8活化，引起细胞凋亡[17-18]。

1.3 穿孔素/颗粒酶途径 T细胞介导的细胞毒性是IV型超敏反应的变体，通过激活CD8+细胞可以杀死携带抗原的细胞。这些细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes，CTLs）能够通过外在途径杀死靶细胞，FasL/FasR相互作用是诱导CTL细胞凋亡的主要方法。然而，CTL可通过肿瘤细胞和感染细胞产生细胞毒性作用，即CTL生成的穿孔素作用于细胞膜，使其产生穿孔蛋白通道，然后向胞内释放细胞质颗粒，颗粒酶A和颗粒酶B是这些颗粒的主要物质。颗粒酶是丝氨酸蛋白酶家族的成员，其中颗粒酶B是一种32 ku的蛋白，可诱导多种组织的细胞凋亡，并代表自然杀伤细胞（Natural Killer Cell，NK）和CTL的细胞毒性颗粒的关键组分[19-20]。其中颗粒酶A途径是通过对DNA损伤，并且不依赖Caspase的细胞死亡途径[21]。颗粒酶B所介导的细胞凋亡途径主要经由激活Caspase-10和Caspase-7而诱导Caspase酶的活化，从而导致细胞凋亡。尽管位于CTL和NK细胞内部的颗粒酶具有细胞溶解作用，但非免疫细胞（颗粒细胞、软骨细胞和支持细胞）中的许多颗粒酶变体具有非凋亡的细胞外功能，如诱导炎症和信号转导[22]。例如，睾丸中颗粒酶的过表达将会从生精小管腔过早释放圆形精子，最终调节生殖细胞凋亡[23]。穿孔素是膜攻击复合物/穿孔素/胆固醇依赖性溶血素超家族的一部分[24]。穿孔素是一种成孔蛋白，在CTL和NK细胞中表达，并与促凋亡丝氨酸蛋白酶颗粒酶通过胞吐作用分泌并一起诱导靶细胞的凋亡。颗粒-胞吐作用途径激活凋亡Caspase的细胞死亡途径，但它也能在Caspase没有被激活的情况下导致细胞死亡。然而，它们还能够通过一种新的途径对不正常的细胞发挥细胞毒性作用，这种途径主要是分泌跨膜孔形成分子穿孔素，最终导致细胞凋亡。另外还包括内质网和溶酶体途径导致的细胞凋亡。内质网主要通过调节Bcl-2家族而引起的细胞凋亡。最新研究发现，还可以通过调控抗凋亡蛋白的转化效率控制细胞凋亡，如使eIF2α大量磷酸化导致细胞变异蛋白蓄积，从而降低BclxL等抗凋亡因子表达效率，最终诱导细胞发生凋亡[25]。热应激下内质网膜上的Ca2+受到影响从而诱导细胞凋亡。溶酶体主要受到H2O2鞘氨醇的刺激产生抗凋亡蛋白组织蛋白酶，从而抑制线粒体膜上Bcl家族表达。

2 HSPs

HSPs是机体在各种应激条件下产生的一类对细胞具有保护作用的高保守蛋白质分子家族。HSP具有强大的细胞保护作用，并且表现为其他细胞蛋白的分子伴侣。分子伴侣作用是纠正错误折叠的蛋白质重新折叠或降解的作用。根据分子量、功能和同源性，HSPs包括几个蛋白家族，其中HSP70家族在进化上是高度保守的，也是目前为止研究最深入的一族，特别是在细胞凋亡途径已经取得了不错的研究[5,26]。值得注意的是，热刺激诱导HSP的表达和积累，证明了死亡刺激可以在细胞中引起保护性反应，HSP具有重要的抗细胞凋亡特性。HSP与关键应激信号传导和凋亡分子相关，从而阻断细胞死亡并促进存活、增殖或分化。

3 HSP70在细胞凋亡途径中的作用

3.1 HSP70通过内在途径对细胞凋亡的影响 HSP70作为抗凋亡蛋白，保护细胞免受TNF、单核细胞、氧化应激、化学药物、神经酰胺和辐射诱导的细胞毒性[27-28]。由一氧化氮和热应激刺激的凋亡级联触发Bax从细胞质转移至线粒体，其被HSP70的过表达抑制而引起细胞凋亡[29]。HSP70是细胞凋亡线粒体途径的决定性负调节因子，通过抑制应激诱导信号传导，可以在前线粒体阶段阻断不同水平的细胞凋亡；在线粒体阶段，通过阻断Bax易位来阻止线粒体膜透化；最后，在线粒体后水平，通过与AIF和Apaf-1相互作用或通过保护必需的核蛋白免受Caspase-3裂解[5]。在线粒体前水平，HSP70抑制应激激活的激酶。HSP70与c-Jun N末端激酶（JNK1）的天然抑制蛋白结合并起作用[30]。HSP70的ATP酶结构域对于这种结合是不必要的。HSP70似乎也影响Bid依赖性细胞凋亡途径。Bid纯合缺失的MEF细胞中缺乏HSP70介导的针对TNF诱导的细胞死亡的保护作用[31]。在线粒体水平，HSP70阻止热诱导的细胞凋亡，阻碍Bax易位并插入外膜，从而阻止线粒体膜透化和细胞色素c和AIF的释放[29]。这种HSP70功能依赖于伴侣蛋白和ATP水解结构域[32]。据报道，在线粒体后水平，HSP70可抑制细胞色素c释放和Caspase-3活化上游细胞凋亡[6]。

HSP70与Apaf-1直接相互作用，并抑制功能性凋亡复合物形成在内在途径的最下游端[33]。HSP70不仅可预防晚期Caspase依赖性事件，如细胞溶质磷脂酶A2的激活和核形态的变化，而且还可以保护细胞免受Caspase-3的强制表达[34]。HSP70的水平升高可以在线粒体的上游和下游阻断不同类型诱导的细胞凋亡。

在TNFα诱导的细胞凋亡中，HSP70不会阻止Caspase-3活化，但会阻止下游形态变化，这种是濒临死亡细胞的特征，如磷脂酶A2的激活和核形态变化[34]。凋亡末期，Caspase激活后导致染色体DNA降解，这种降解DNA的酶称为Caspase活化的DNA酶（Caspase Activated DNase，CAD）。在TCR刺激的T细胞中也报道了HSP70结合CAD并增强其活性[35]。

3.2 HSP70通过在外在途径对细胞凋亡的影响 HSP70通过外在途径发挥多种功能从而对细胞起到保护作用，这些功能包括抵抗功能、抑制功能、载体功能和磷酸化功能。HSP70通过死亡受体介导疾病中Bcr-Abl依赖性对细胞凋亡的抵抗性：一方面，HSP70与死亡受体DR4和DR5结合，从而抑制TRAIL诱导的死亡诱导信号复合物（DISC）的组装和活性[36]；另一方面，HSP70可通过抑制Fas介导的细胞凋亡来保护心肌细胞免受应激诱导的损伤[37]。HSP70作为抗原呈递细胞活化细胞因子或抗原肽，发挥载体蛋白的作用；HSP70的磷酸化形式直接与Daxx相互作用，将Fas信号传导与蛋白激酶Ask1连接，并且不依赖Caspase的细胞死亡[38]，而Caspase-8一旦被激活，就会触发细胞凋亡的执行阶段，源于死亡受体介导的细胞凋亡称为c-FLIP的蛋白抑制，该蛋白将与FADD和Caspase-8结合，抑制了凋亡程序。总之，TRAIL诱导细胞凋亡的关键调节因子是FLIP。

内质网和溶酶体途径在细胞凋亡也起着重要确定性作用。内质网作为细胞内一种重要的细胞器，参与蛋白合成后折叠、细胞对应激的反应等活动，同时也是Ca2+的最主要储存库[39]。当机体受到热应激刺激，体内的蛋白合成受到影响，特别是HSP70的合成增加，严重时则能诱导细胞凋亡。在许多不同的细胞死亡情况下，溶酶体还可作为细胞死亡信号的整合体。溶酶体可以分泌蛋白酶，其中组织蛋白酶是研究最深入的，组织蛋白酶从溶酶体腔释放到细胞质，从而对多种凋亡刺激做出反应[40]。组织蛋白酶释放还可以对细胞造成凋亡，其不依赖于Cyt c或AIF的线粒体释放。HSP70存在于许多肿瘤和应激细胞的内溶酶体膜中，它抑制溶酶体组织蛋白酶释放到胞质溶胶中，从而保护细胞抗凋亡[41]。

3.3 HSP70通过穿孔素/颗粒酶途径对细胞凋亡的影响穿孔素是CTL介导和颗粒酶促进的细胞内过程的主要调节剂。颗粒酶A和颗粒酶B诱导多个独立细胞死亡途径而导致细胞凋亡。活化的NK细胞杀死膜HSP70阳性肿瘤细胞的机制与促凋亡丝氨酸蛋白酶颗粒酶B的产生和释放增加相关[42-43]。此外，颗粒酶B诱导的HSP70阳性肿瘤细胞凋亡发生在穿孔素不存在，并且颗粒酶B与HSP70膜形式的相互作用依赖于颗粒酶B的真核糖基化模式[44]。

4 小结与展望

总之，细胞凋亡是一个极其复杂的、精确调控的、蛋白酶及能量依赖的分子级联反应过程，其中Caspase的活化起重要决定作用。HSP70家族是高度保守的蛋白，与其他蛋白有很多互作。热应激导致HSP70升高，HSP70通过不同的死亡途径介导细胞凋亡，并且热应激是诱导细胞损伤的机制之一。如果HSP70通过线粒体外膜透化作用来阻止细胞凋亡，则需要抑制Caspase、凋亡诱导因子、核酸内切酶G以及可能是其他不依赖于caspase的细胞死亡介质的活性。HSP70通过穿孔素/颗粒酶调节死亡途径，这有可能是一种新的凋亡途径。此外，热应激下HSP70的表达和分布与细胞损伤的程度之间存在明显的相关性。