电场技术对于热带水果保鲜机理影响研究

任 猛 左秋杰

（长虹美菱股份有限公司 合肥 230001）

引言

前期研究发现，电场条件下保鲜效果存在明显差异，具体表现在：①不同电场条件下保鲜效果的差异；②不同代谢类型果蔬电场作用效果的差异，主要表现在呼吸跃变型和非呼吸跃变型水果。而根据文献以及资料搜集，并无相关的研究分析。

果蔬作为活体，需要进行一系列的代谢维持机体正常的生活活动，包括营养物质合成代谢和消耗代谢，而这些代谢活动强弱均由相关的酶所催化。根据生物学遗传知识，酶由基因编码控制，因此果蔬代谢的相关变化其实就是代谢途径中相关酶活性及其含量发生变化的结果，所有的生命活动均由基因所控制[1]。从基因层面解析电场处理的保鲜机理，根据电场处理对水果基因表达的影响进行研究，找到电场处理对于热带水果代谢影响等更深层次的机理，能够更好解释电场对于热带水果作用的机理。本文通过实验分析不同电场强度下对于呼吸跃变型果蔬乙烯的释放以及呼吸强度的影响，确定电场适宜的催熟处理条件。实现电场技术优化的同时，解决热带水果存储难的问题，为热带水果在冰箱中的保鲜提供技术以及理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料选择及依据

选择香蕉作为电场处理的研究材料，电场为高压静电场，电场强度为30～200 V内。由于香蕉作为热带水果，具有可靠的基因组信息资源可供利用，便于后续的基因信息挖掘。电场强度选择根据前期保鲜效果试验结果确定。

1.2 试验设备

美菱BCD-481WQ3M冰箱2台，高压静电场模块、气相色谱仪等。

1.3 分析方法

测定电场条件下香蕉代谢基因表达差异性，结合主要代谢指标（酶活、丙二醛、乙烯）数据，分析电场热带水果保鲜的机理。

2 试验方法

2.1 基因分析方法

选择香蕉作为试验材料，通过电场处理，进行转录组分析。测试样品分别存储在适宜温度（12 ℃）条件下设有电场模块的冰箱以及对照冰箱。每两天测试乙烯释放量，在最佳效果的时间点取样（根据对照与试验组数据出现明显差异判断），提取样品总RNA进行转录组测序和分析，统计差异基因，结合代谢通路进行分析。

2.2 酶活性测试

2.2.1 酶液的提取

称取样品10 g预冷研磨，加入20 mL 经预冷处理的95 %乙醇，低温静置10 min后，低温4 ℃下12 000 r/min离心20 min，去除上清液。重复上述操作后，加入5 mL预冷的1.8 mol/L NaCl提取缓冲溶液（50 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为5.5），4 ℃条件下放置20 min，离心后收集上清液，于 4 ℃ 保存。

2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶[2]活性测定

取2支试管，均加入1 mL 50 mmol/L，pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液和0.5 mL 10g/L多聚半乳糖醛酸溶液（1.0 g多聚半乳糖醛酸溶于100 mL 50 mmol/L pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液），1支试管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL经煮沸5 min的酶提取液作为对照并标记，混匀后在37 ℃保温1 h，保温后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸 （DNS），沸水浴 5 min，取出后经流水冷却，蒸馏水稀释至25 mL，在540 nm处测定吸光度。计算酶活，公式如下：

式中：

M′—从标准曲线查的葡萄糖质量，mg；

V—样品提取液总体积，mL；

VS—测定时索取样品提取液体积，mL；

T—酶促反应时间，h；

M—样品质量，g。

2.2.3 羧甲基纤维素酶活性测定

取2支试管，每支加入1.5 mL底物（底物配制:称取1.0 g羧甲基纤维素钠溶于 pH值为5.0的 50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，定容到100 mL），1支试管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL经煮沸5 min的酶提取液作为对照，混匀后在37 ℃保温1 h，保温后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS），沸水浴 5 min，取出后经流水冷却，蒸馏水稀释至25 mL，在540 nm处测定吸光度。

计算公式：

式中：

m′—从标准曲线查的葡萄糖质量，mg；

V—样品提取液总体积，mL；

VS—测定时索取样品提取液体积，mL；

T—酶促反应时间，h；

M—样品质量，g。

3 结果与分析

3.1 测序样品乙烯释放量的测定

从表1中可以看出，香蕉从第4 天开始乙烯释放量开始出现差异，第6天的差异比较显著，显示了通过抑制乙烯达到保鲜的效果，由此选择最佳电场强度处理6 d的香蕉作为测序的样品。

3.2 香蕉Unigene功能注释及相关性分析

根据测试分析，71 139个unigenes被成功注释。Unigenes有48.72 %与Nr数据库一致，有30.76 %的unigenes得到GO注解，分别有20.77 %，11.88 %和31.91 %的 unigenes得到KEGG，COG，Pfam数据库的注释。香蕉unigenes功能注释图见图1。

通过样品之间相关性的分析（如图2），可观察组内样品之间的生物学重复性。同时组内样品相对组间样品的相关系数越高，获得的差异代谢物越可靠，且验证了试验设计的合理性。如图3～5所示，可以看到相关系数均在0.92以上，说明测定的样本稳定性较好，获得的数据质量高，可以进行下一步的转录组测序分析。

表1 香蕉在不同电场强度的乙烯释放量

图1 香蕉unigenes功能注释图

图2 香蕉相关性分析

图3 香蕉差异基因统计图

图4 差异基因富集分析

3.3 差异基因的筛选

电场处理果实中有150个基因的表达水平受到显著影响，进一步研究发现这150个基因中有127个基因的表达量增加了，而剩下的23个基因表达量下降了，如图3～5所示；进一步分析发现，这有150受到电场处理影响的基因里面有3个与乙烯有关，7个与细胞壁代谢有关以及32个与细胞膜结构和代谢有关（见表2），这些基因的表达变化会影响到电场处理后的果实乙烯生成情况，果实软化和细胞膜的透性或者衰老特性。除此之外，其他受到电场处理的差异表达基因大多是和蛋白质的折叠和加工相关，这些蛋白与果实的保鲜关系不大。

表2 与乙烯，细胞壁以及细胞膜相关的差异基因统计表

图5 植物信号转导代谢通路图

考虑到上述差异基因大部分集中于生物体的蛋白质加工和代谢过程，这些与保鲜关系不大。参考差异基因以及代谢通路，结合乙烯释放量的差异，电场处理导致了香蕉中的乙烯信号传导途径关键酶编码基因EIN3受到影响，抑制乙烯的信号转导过程，阻断乙烯在细胞间的传递，使乙烯不能和乙烯受体结合，也就是细胞不能感受到乙烯信号，最终延缓水果的成熟衰老过程；另外，在植物激素信号转导通路中发现，细胞在油菜素类固醇正常生成后，油菜素类固醇作为一种信号调控关键酶基因TCH4（木葡聚糖:木葡萄糖基转移酶）被电场处理后显著上调表达，也就意味着木葡聚糖：木葡萄糖基转移酶的活性得到增强，促进细胞壁半纤维素类多糖—木葡聚糖的生成，促进细胞壁的生成和活性，从而控制细胞增大，保持细胞硬度，维持水果新鲜度。电场施加之后，作为一种信号进入植物MAPK信号通路中，调控信号通路中的关键酶的基因RBOH（呼吸爆发氧化酶）上调表达，RBOH作为一种呼吸作用氧化酶，以氧气和过氧化氢为受体，可以消耗细胞内的氧化物质，维持细胞内的活性氧的稳态，防止细胞氧化包括细胞膜的过氧化，维持细胞内正常氧化还原状态，避免细胞膜的破坏，维持细胞活性，延缓了植物衰老，维持良好品质。

3.4 生理指标的测试

上述试验从基因水平解析了电场处理对果实保鲜相关代谢途径中关键基因的影响，包括乙烯生物合成和信号传导，细胞壁的代谢等。生理指标测试从细胞和蛋白水平了解电场处理对细胞壁代谢和细胞衰老的影响。其中细胞壁代谢影响果实的软化，细胞电导率和氧化能力反应细胞的衰老水平，也间接反应果实的保鲜效果。其中细胞壁代谢相关酶选择了多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶；细胞衰老相关指标选择丙二醛含量指标测定。

由表3可以看出，香蕉在电场中其多聚半乳糖醛酸酶，纤维素酶活性均低于对照组香蕉相应酶的活性，说明30～200 V电场可以有效抑制这两种细胞壁酶的活性，抑制了细胞壁的降解，延缓果实软化；香蕉在电场强度中丙二醛含量和电导率也低于对照组，说明电场可以有效抑制细胞膜过氧化，降低膜的通透性，保持细胞活性，延缓衰老过程，保持水果新鲜度，与转录组的数据分析相吻合，香蕉生理指标测定结果均说明电场对水果的细胞壁和细胞膜不产生伤害，维持细胞壁和细胞膜的完整性和功能，延缓果实软化和衰老过程，保持果实新鲜。

表3 香蕉电场处理第6天生理指标测定表

4 结论

综合得知，电场保鲜对于水果的保鲜机理是通过抑制乙烯信号传导过程关键基因，抑制乙烯在细胞内的传递，使乙烯不能与受体结合，实现果蔬催熟过程抑制的同时，调控细胞壁多糖代谢过程，调控与细胞壁相关酶基因，实现酶活性的调节，具体表现在促进细胞壁的生成，维持细胞活性。