多粘类芽孢杆菌发酵法提取银杏黄酮

马波，孙林歆，乔友志

(江苏师范大学 连云港校区，江苏 连云港 222006)

银杏叶为银杏科银杏属植物银杏(GinkgobilobaL.)的干燥叶，富含黄酮类物质，这些生物活性物质具有抗病毒、抗氧化、抗高血压、降血糖和降血脂等功效[1-2]，作为食品添加剂，如色素、甜味剂、抗氧化剂等，广泛应用于调味食品、调色食品和保健食品中[3-7]。目前，从银杏叶中提取黄酮的方法包括醇提法、超声法、微波法、酶法和复合法等[8-15]。

银杏黄酮类化合物几乎被以果胶、纤维素为主要物质构成的细胞壁所包围，传质阻力巨大，不利于溶剂进入细胞壁内，影响银杏黄酮的提取效果。液态发酵多粘类芽孢杆菌过程中能产生果胶酶，可充分降解提取物细胞间果胶质，降低细胞间的粘连性，使细胞壁疏松、破裂，减小传质阻力，促进细胞内容物的充分浸出[16-17]，是目前酶法中常用的酶。鉴于此，本文通过多粘类芽孢杆菌发酵法提取银杏黄酮，以银杏黄酮得率为指标，在探讨了单因素试验的基础上，利用正交试验优化提取条件，为银杏黄酮的进一步开发应用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

银杏叶：产于江苏师范大学连云港校区，烘干粉碎，过40目筛制成银杏叶粉；菌种：多粘类芽孢杆菌2018(Paenibacilluspolymyxa)；芦丁标准品、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、玉米浆、葡萄糖、NaCl、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O：所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

101-0干燥箱 上海昕仪仪器仪表有限公司；20B高效粉碎机 常州乐星干燥设备有限公司；BIOBASE高压蒸汽灭菌锅 山东博科科学仪器有限公司；UV2550分光光度计 日本岛津公司；KL-100B恒温培养振荡器 上海凯朗仪器设备厂；RE-52CS旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 银杏黄酮含量测定

银杏黄酮含量测定：以芦丁为标准，配制不同浓度的芦丁标准液，以芦丁浓度为横坐标，溶液吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，得到质量浓度C(mg/mL)与吸光度A关系的线性回归方程为C=1.51A+0.0002，R=0.9999。

1.3.2 银杏黄酮提取得率计算

银杏黄酮提取得率(%)=(银杏黄酮含量×提取液体积/所用银杏叶质量)×100%。

1.3.3 培养基

斜面培养基(m/V)：蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂2.0%，pH 7.0。

种子培养基(m/V)：蛋白胨1.0%，玉米浆3.0%，蔗糖2.0%，硫酸镁0.1%，K2HPO4·3H2O 1.8%，KH2PO40.6%，pH 7.0。

发酵培养基(m/V)：蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4·3H2O 0.9%，KH2PO40.3%，pH 7.0。

1.3.4 提取工艺

参考银杏叶中果胶类物质和黄酮类物质的性质，采取了两种提取技术。

1.3.4.1 直接浸提技术

银杏叶粉末→浸泡→减压过滤→浓缩→定容。

取银杏叶粉末10 g加入200 mL蒸馏水中，在温度80 ℃浸泡处理24 h，使黄酮类物质能够充分释放，然后进行过滤，取滤液浓缩定容后测银杏黄酮含量。

1.3.4.2 芽孢杆菌发酵法提取技术

银杏叶粉末→发酵培养基→灭菌→接种→发酵→减压过滤→浓缩定容。

取活化后的多粘类芽孢杆菌两环，接入种子培养基中，在摇床温度35 ℃，转速150 r/min条件下发酵24 h，培养种子液。将8 g银杏叶粉末添加到发酵培养基中(200 mL)，灭菌后再接入10%的种子培养液，设置摇床温度35 ℃，转速180 r/min条件下发酵24 h。发酵完成后将发酵液减压过滤，取滤液浓缩定容后测银杏黄酮含量。

1.3.5 优化芽孢杆菌发酵法提取技术

分别考察种子液菌龄、固液比(银杏叶粉末质量/发酵培养基体积)、接种量、发酵温度和发酵时间的变化对银杏黄酮提取得率的影响。在此研究的基础上，通过L9(34)正交表(见表1)来研究固液比、发酵温度、接种量、发酵时间对银杏黄酮提取得率的影响。

表1 正交试验的因素与水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 种龄对提取得率的影响

将不同培养时间的种子液转入到发酵培养基中培养后，测定黄酮提取得率，见图1。

图1 种龄对提取得率的影响Fig.1 The effect of seed age on extraction yield

由图1可知，随着种子培养时间的延长，提取得率明显上升，当种子培养时间足够长后，提取得率又开始下降，因此，24 h为种子的最佳培养时间。

2.2 不同固液比对提取得率的影响

在上述种子培养时间的基础上，考察不同固液比对提取得率的影响，见图2。

图2 固液比对提取得率的影响Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由图2可知，固液比小于5∶100 (g/mL)，提取得率随固液比的增大而增加，当固液比为5∶100 (g/mL)时，提取得率达到最大值。当固液比超过5∶100 (g/mL)时，提取得率有下降趋势。当银杏叶比例太小时，银杏叶中果胶类物质的浓度未能使酶达到饱和，抑制果胶酶的作用，导致提取得率低。而当银杏叶比例太大时，酶含量相对较低，致使银杏叶细胞壁和细胞间存在的果胶类物质未被降解完全，同时溶剂量少，阻碍了黄酮类物质进一步溶出。

2.3 不同接种量对提取得率的影响

基于以上优化条件，考察不同接种量对提取得率的影响，结果见图3。

图3 接种量对提取得率的影响Fig.3 The effect of inoculation amount on extraction yield

由图3可知，在一定范围内，随着接种量的增加，提取得率增加，接种量12%时，提取得率最高。接种量过少则菌体增长缓慢，代谢果胶酶不足，导致提取得率低；接种量过多使菌体生长速度过快，培养基营养相对不足，导致菌体提前衰老自溶，产酶量下降，影响提取得率。

2.4 不同发酵温度对提取得率的影响

基于以上优化条件，考察不同发酵温度对提取得率的影响，结果见图4。

图4 发酵温度对提取得率的影响Fig.4 The effect of fermentation temperature on extraction yield

由图4可知，提取得率随着发酵温度的增加呈先升高后降低的趋势。适宜的发酵温度不仅可以促进多粘类芽孢杆菌的生长及代谢，同时还能增大酶活[18]，促进果胶类物质的降解，提高提取得率，当发酵温度达到35 ℃时，提取率达到最大值。

2.5 不同发酵时间对提取得率的影响

基于以上优化条件，考察不同时间对提取得率的影响，结果见图5。

随着发酵时间的延长，提取得率增加，当发酵至28 h时，提取得率最高；随着时间的继续延长，银杏黄酮提取得率逐渐降低。这是因为开始阶段，随着发酵的进行，代谢产物果胶酶不断累积且与底物充分反应，破坏细胞壁，使得银杏叶中的黄酮不断浸出，提取得率提高。在28 h后，黄酮已基本释放出来，没有再继续延长发酵时间的必要。

图5 发酵时间对提取得率的影响Fig.5 The effect of fermentation time on extraction yield

2.6 正交试验

基于上述单因素试验，选取种子培养时间为24 h，考察固液比、接种量、发酵温度、发酵时间对银杏黄酮提取得率的影响，结果见表2。

表2 正交试验结果与分析Table 2 The results of orthogonal experiment

通过对表2的极差分析，得到银杏黄酮提取的最佳工艺条件为A2B1C2D2，即固液比5∶100 (g/mL)、接种量10%、发酵温度35 ℃、发酵时间28 h。4个因素对银杏黄酮提取得率的影响为固液比>发酵时间>发酵温度>接种量。在上述提取银杏黄酮的最佳条件下进行试验，得到银杏黄酮提取得率为4.34%。

采用直接浸提技术，得到银杏黄酮提取得率为1.09%。多粘类芽孢杆菌发酵产生的果胶酶使植物细胞间的果胶质降解，促进细胞从组织中分离，同时还可以水解细胞壁中的果胶类物质，破除细胞壁[19]。提取液在摇床中不断振荡，也可明显促进黄酮类物质的释放。该方法不需要复杂的酶分离提纯操作，降低了生产成本，有利于经济效益的提高。因此，微生物破壁法对于黄酮类物质的提取行之有效。

3 结论

利用多粘类芽孢杆菌发酵法提取银杏叶中的黄酮。最佳提取条件为：种龄24 h，固液比5∶100 (g/mL)，接种量10%，发酵温度35 ℃和发酵时间28 h时提取得率较高，银杏黄酮提取得率为4.34%，相比直接浸提的提取率1.09%，较大提高了银杏黄酮的提取得率，为银杏叶中黄酮类物质的高效提取提供了试验依据。