凝胶色谱-HPLC及LC/MS/MS法测定食品中苏丹红染料

彭飞进，杨云华，李艳梅，李芹超，高小林，段加权，刘黔

(云南华测检测认证有限公司，昆明 650214)

苏丹红属偶氮系列化工合成染料，2008年被列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》第一批“食品中可能违法添加的非食用物质名单”，名单中苏丹红被列入可能违法添加至辣椒粉中作为着色使用，2011年公布第五批名单时，将苏丹红可能违法添加的产品类别进行修订，“产品类别”中增加“含辣椒类的食品(辣椒酱、辣味调味品)”，近年来国家对含辣椒、蛋黄的食品在监督抽检时均要求检测苏丹红，而辣椒类产品是我国常见的食品之一[1-2]，因此开发一种准确、高效的检测方法有利于筛查食品中苏丹红非法使用情况，有利于保障食品安全。

目前检测苏丹红的国家标准GB/T 19681—2005《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》采用正己烷提取，固相萃取柱净化，高效液相色谱仪分析，该方法的难点在于手动装填氧化铝层析柱，受人员熟练度和试剂等不确定度影响较大，采用高效液相色谱仪检测时，如果苏丹红I、II、III、IV分离较差，将影响定性和定量，其他已发表的关于苏丹红检测方法的主要以GPC净化高效液相色谱检测苏丹红为主[3-7]，少数为固相萃取柱净化高效液相色谱检测和固相萃取柱净化LC/MS/MS检测等[8-10]，本文利用凝胶色谱较好的分离净化功能，对辣椒粉、辣椒酱、腐乳、辣条、鸭蛋、橙子等多种食品进行检测，实验结果显示回收率在75%～120%之间，同时采用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱串联质谱联用仪(LC/MS/MS)分析，可以有效排除假阳性，灵敏度高，最低检出限为5 μg/kg。

1 实验部分

1.1 主要仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；ΜPLC-XEVO TQ-S Micro液质质联用仪(LC/MS/MS) 美国沃特世公司；N-1300D-WB旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；LE204E分析天平(精度0.1 mg) 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 试剂与材料

苏丹红I、II、III标准物质(浓度100 μg/mL)：购自农业部环境保护科研检测所；苏丹红IV：购自Dr. Ehrenstorfer公司；正己烷、环己烷、乙酸乙酯(色谱纯)：购自上海星可高纯溶剂有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯)：购自上海安谱实验科技股份有限公司；其他所有试剂均为分析纯；实验室用水为超纯水；样品购自于当地市场。

1.3 实验条件

液相色谱法条件：InertSustain C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱温 40 ℃，进样量 40 μL，流动相为乙腈和水(92∶8)等度洗脱，流速1.0 mL/min，PDA检测器，检测波长518 nm。

液相色谱-质谱-质谱条件：ACQΜITY ΜPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，进样量3 μL，流动相为甲醇(A)和4 mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)(B)梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速0.3 mL/min，电喷雾正离子扫描模式，多反应监测(MRM)，离子源温度500 ℃，喷雾电压3000 V，脱溶剂温度500 ℃，质谱参数见表2。

表1 LC/MS/MS流动相梯度洗脱程序Table 1 LC/MS/MS mobile phase gradient elution procedure

表2 苏丹红质谱分析参数Table 2 The mass spectrometry parameters of Sudan red

1.4 前处理过程

称取1.0 g(准确至0.01 g)样品于离心管中，加20 mL水与正己烷涡旋混匀后，超声30 min，取出，以4000 r/min离心5 min, 取出正己烷层于150 mL鸡心瓶中，再在残渣中加入20 mL正己烷匀浆，涡旋混匀，4000 r/min离心5 min，合并2次正己烷，于旋转蒸发仪上旋干，用5 mL环己烷∶乙酸乙酯为1∶1复溶残渣，经0.45 μm有机滤膜过滤后，上GPC仪器乙酸乙酯∶环己烷(1∶1)净化，净化后液体转移至150 mL鸡心瓶中，于旋转蒸发仪上旋干，用乙腈定容1 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤后分别上HPLC和LC/MS/MS检测。

2 结果与分析

2.1 液相色谱检测情况

标准储备液浓度及编号：苏丹红4项-5(180809 01)10 mg/L。液相色谱标准曲线表和标准溶液配制表分别见表3和表4，苏丹红I、II、III、IV曲线图分别见图1～图4。

表3 液相色谱标准曲线表Table 3 The standard curve table for liquid chromatography

表4 液相色谱标准溶液配制表Table 4 Liquid chromatography standard solution preparation table

图1 苏丹红I曲线图Fig.1 The curve graph of Sudan red I

图2 苏丹红II曲线图Fig.2 The curve graph of Sudan red II

图3 苏丹红III曲线图Fig.3 The curve graph of Sudan red III

图4 苏丹红IV曲线图Fig.4 The curve graph of Sudan red IV

选取阴性基质鸭蛋、辣椒酱、辣椒粉、腐乳、辣条、橙子分别添加3个不同浓度的苏丹红标液做回收率实验，实验结果见表5～表10。

表5 鸭蛋回收率结果表Table 5 The recovery rates of duck eggs

表6 辣椒酱回收率结果表Table 6 The recovery rates of chili sauce

表7 辣椒粉回收率结果表Table 7 The recovery rates of paprika

表8 腐乳回收率结果表Table 8 The recovery rates of fermented bean curd

表9 辣条回收率结果表Table 9 The recovery rates of spicy strip

表10 橙子回收率结果表Table 10 The recovery rates of oranges

前处理未过GPC净化和过GPC净化分别见图5和图6。

图5 未过GPC净化的样品和标物对比图Fig.5 Comparison diagram of samples and standard substances before GPC purification

图6 过GPC净化的样品图Fig.6 The diagram of samples after GPC purification

2.2 液相色谱-质谱-质谱检测情况

LC/MS/MS标准曲线表(曲线浓度与液相一致)和苏丹红标准物质曲线图分别见图7～图10，相关系数在0.99以上，苏丹红标准物质质谱图见图11。

图7 LC/MS/MS苏丹红I标准物质曲线图Fig.7 The curve graph of Sudan red I standard substances by LC/MS/MS

图8 LC/MS/MS苏丹红II标准物质曲线图Fig.8 The curve graph of Sudan red II standard substances by LC/MS/MS

图9 LC/MS/MS苏丹红III标准物质曲线图Fig.9 The curve graph of Sudan red III standard substances by LC/MS/MS

图10 LC/MS/MS苏丹红IV标准物质曲线图Fig.10 The curve graph of Sudan red IV standard substances by LC/MS/MS

图11 LC/MS/MS苏丹红I、II、III、IV标准物质质谱图Fig.11 The mass spectrograms of Sudan red I, II, III, IV standard substances by LC/MS/MS

选取阴性基质辣椒酱、辣椒粉、腐乳分别添加3个不同浓度的苏丹红标液做回收率实验，实验结果见表11～表13。

表11 辣椒酱回收率结果表Table 11 The recovery rates of chili sauce

表12 辣椒粉回收率结果表Table 12 The recovery rates of paprika

表13 腐乳回收率结果表Table 13 The recovery rates of fermented bean curd

根据上述结果分析，液相色谱检测时选取518 nm波长比国家标准苏丹红II、III、IV的波长520 nm的响应要高，因此可以提高检出限，不用GPC净化时，在基质比较复杂的样品如辣椒酱中，容易出现苏丹红IV干扰，出现假阳性，用GPC净化效果很好，无杂质干扰，液相检测相应回收率和稳定性较好，液质质基质效应较大，回收率偏高，但是定性准确，如果通过净化消除杂质干扰时，可以通过液质质选择质谱离子来定性，因此有检出苏丹红时，可以用两种仪器同时定性和定量。

3 结论

利用凝胶色谱净化，对鸭蛋、辣椒粉、辣椒酱、腐乳、辣条、橙子等多种食品进行检测，实验结果显示回收率在75%～120%之间，高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-串联质谱-质谱联用仪(LC/MS/MS)对辣椒粉、辣椒酱和腐乳分析回收率均较好，可以有效排除假阳性，灵敏度高，稳定性好，是苏丹红检测的有效方法。