姜黄素对脑缺血再灌注自发性高血压大鼠认知功能的影响

曾明 许忠 徐凯

摘要 目的：探討姜黄素对脑缺血再灌注自发性高血压（SH）大鼠认知功能的影响。方法：选取75只大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组，每组25只;模型组和实验组构建脑中动脉栓塞（MCAO）模型，假手术组不阻塞大脑中动脉血供;实验组于术前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黄素100 mg/kg，假手术组和模型组注射等量生理盐水。检测大鼠认知功能、缺血侧海马区神经元凋亡及相关蛋白的表达。结果：缺血再灌注2～72 h，与假手术组比，模型组神经元凋亡细胞数量增多，而实验组较模型组减少;模型组穿台次数减少，实验组多于模型组;模型组逃避潜伏期延长，实验组短于模型组;模型组缺血侧海马区磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白含量高于假手术组，实验组PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型组，Caspase-3蛋白低于模型组（均P<0.05）。结论：姜黄素可减轻脑缺血再灌注SH大鼠神经元凋亡程度，改善认知功能，其机制与上调PI3K、p-AKT蛋白表达及下调Caspase-3蛋白表达相关。

关键词 高血压;脑缺血再灌注;姜黄素;神经元凋亡;认知

Abstract Objective：To investigate the effect of curcumin on cognitive function in spontaneously hypertensive （SH） rats with cerebral ischemia reperfusion. Methods：A total of 75 cases of SH rats were selected and randomly divided into a sham operation group， a model group and a test group， with 25 cases in each group. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model was established in model group and test group， while the sham operation group did not block the blood supply of the middle cerebral artery; test group received intraperitoneal injection of curcumin 100 mg·kg-1 at 30 min before operation and 6 h after reperfusion， sham operation group and model group were given intraperitoneal injection of the same amount of normal saline. The cognitive function， neuronal apoptosis and the expression of related proteins in the hippocampus of the ischemic side were detected. Results：After 2 h-72 h of cerebral ischemia and reperfusion， compared with sham operation group， the number of apoptotic neurons in model group increased， while the test group was less than the model group; the number of crossings reduced， and the test group was more than the model group; the escape latency prolonged， and the test group was shorter than the model group; the content of phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）， phosphorylated protein kinase B （p-AKT） and cysteine aspartate protease-3 （Caspase-3） in ischemic side hippocampus of rats in model group were higher than those in sham operation group， while the content of PI3K and p-AKT in test group were higher than model group， Caspase-3 was lower than model group （all P<0.05）. Conclusion：Curcumin can relieve neuronal apoptosis degree and improves cognitive function in SH rats with cerebral ischemia and reperfusion， and the mechanism is related to the up-regulation of PI3K， p-AKT protein and down-regulation of Caspase-3 protein expression.

Keywords Hypertension; Cerebral ischemia reperfusion; Curcumin; Neuronal apoptosis; Cognition

中图分类号：R285.5;R544.1 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.008

目前缺血性脑卒中已成为严重危害人类健康的疾病，而高血压是脑卒中发生的重要危险因素之一，缺血性脑卒中后常造成脑水肿及脑出血等再灌注损伤，影响了患者预后[1]。姜黄素具有抗炎、抗氧化等广泛的药理活性，且具有毒性小，不良反应少等优势[2]。而目前研究发现，氧化应激、细胞凋亡及炎性反应均是导致脑缺血再灌注损伤的重要机制，因此本研究探讨姜黄素对脑缺血再灌注自发性高血压（SH）大鼠的作用及对海马神经元凋亡与认知功能的影响[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 由野生型WKY大鼠基因突变后近交繁衍的SPF级SH大鼠，雄性，8周龄，体质量180～220 g，购自南方医科大学实验动物中心（合格证号：粵检证字第2008A053号），所有SH大鼠静态下尾动脉收缩压>160 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）。饲养环境：南方医科大学实验动物中心屏障环境动物实验室，湿度（55±2）%，温度（25±2）℃，光照明暗时间比为12 h/12 h。本实验操作遵循实验动物伦理学要求（伦理审批号：2017421）。

1.1.2 药物 姜黄素，纯度99%，生产批号：050124，美国Sigma-Aldrich公司生产。

1.1.3 试剂与仪器 DNA断裂的原位末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒（Merck Millipore公司，美国，货号：AAT-22844）;磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）与磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体（Santa Cruz公司，美国，货号：FK-CV0876R）;半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase-3）抗体（Cell Singnaling Technology公司，美国，货号：XY-039-17401）;SH11/YF-9光学显微镜（Olypmus公司，日本，SH11/YF-9型）;Meta-Morph凝胶成像分析系统（Media Cybernetics公司，美国，Meta-Morph型）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将75只SH大鼠随机分为假手术组（n=25）、模型组（n=25）和实验组（n=25）;模型组和实验组大鼠采用Longa法构建脑中动脉栓塞（MCAO）模型，假手术组尼龙线栓进线5 mm左右，不阻塞大脑中动脉血供[4]。

1.2.2 给药方法 实验组于术前30 min及再灌注后6 h腹腔注射姜黄素100 mg/kg，假手术组和模型组腹腔注射生理盐水10 mL/kg。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 TUNEL法[5]检测各组大鼠缺血侧海马区神经元凋亡情况 脑缺血再灌注2 h、12 h、24 h及72 h后，每组取出5只断头取出脑组织，制作海马区冠状石蜡切片，并经脱蜡、水化处理后，按照试剂盒说明书操作，显微镜下观察，并计数每个视野阳性细胞数（200倍视野下），细胞核被染成黄褐色即为凋亡细胞，细胞核为蓝色即为正常细胞。

1.2.3.2 Morris水迷宫系统[6]测定各组大鼠认知功能 脑缺血再灌注7 d，采用Morris水迷宫系统测定各组剩余大鼠的认知功能。第1～5天进行定位航行实验，采用Any-maze动物行为学分析软件记录大鼠游泳轨迹及逃避潜伏期（120 s内寻找平台的时间）;第6天进行空间探索实验，记录120 s穿台次数。

1.2.3.3 蛋白免疫印迹法（WB）[7]检测各组大鼠缺血侧海马区相关蛋白的表达 取保存的大鼠海马组织（脑缺血再灌注24 h），制成组织匀浆，电泳后转膜，加入PI3K、p-AKT、Caspase-3一抗，4 ℃摇床过夜，随后室温孵育相对应的二抗1 h。最后用Meta-Morph凝胶成像分析系统分析各条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料用（±s）表示，组内不同时间点数据分析采用重复测量方差分析，2组间比较进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠缺血侧海马区神经元凋亡情况   TUNEL细胞染色可见，假手术组大鼠海马区细胞核核质界限清晰，细胞结构完整，排列均匀;模型组可见细胞染色加深，分布杂乱，神经元周围大量空泡;实验组则出现较多正常神经元。脑缺血再灌注2～72 h，各组大鼠海马区神经元凋亡细胞均呈逐渐升高趋势（P<0.05）。与假手术组比较，脑缺血再灌注2～72 h模型组大鼠海马区神经元凋亡细胞数量增多（P<0.05），而脑缺血再灌注12～72 h实验组大鼠海马区神经元凋亡细胞数量减少（P<0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠认知功能的比较 假手术组、模型组及实验组穿台次数（次）分别为（16.35±3.52）、（7.67±2.14）、（12.41±3.72）。与假手术组比较，模型组穿台次数显著减少，第1～5天的逃避潜伏期均延长（P<0.05）;与模型组比较，实验组穿台次数显著增多，第1～5天逃避潜伏期均缩短（P<0.05）。见图2。

2.3 各组大鼠缺血侧海马区相关蛋白表达 假手术组、模型组及实验组缺血侧海马区PI3K蛋白相对表达量为（0.65±0.12）、（1.97±0.52）、（2.37±0.42），p-AKT蛋白相对表达量为（0.35±0.09）、（1.94±0.63）、（2.62±0.23），Caspase-3蛋白相对表达量为（0.12±0.05）、（1.86±0.63）、（0.51±0.22）。模型组缺血侧海马区PI3K、p-AKT、Caspase-3蛋白含量均高于假手术组，实验组缺血侧海马区PI3K、p-AKT蛋白含量高于模型组，Caspase-3蛋白低于模型组（P<0.05）。見图3。

3 讨论

脑缺血后再灌注损伤是缺血性脑卒中的主要生理病理过程，也是目前临床研究的热点[8-9]。脑缺血急性期神经细胞以凋亡与坏死并存，且海马CA1区对缺血与低氧极为敏感，也是影响患者学习和记忆的关键区域[10-11]。本研究结果显示，脑缺血再灌注损伤后模型组大鼠神经元凋亡细胞数量增多，损伤严重，且认知水平降低，提示脑缺血再灌注损伤SH大鼠存在明显的神经元凋亡及认知缺陷。

姜黄素对肝脏、心脏缺血再灌注损伤具有较好的保护作用，通过下调脂肪氧化酶、环氧化酶-2（COX-2）等因子水平，抑制炎性反应因子的产生;通过下调细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达保护内皮细胞免受肿瘤坏死因子-α（TNF-α）损伤[12-13]。本研究结果中，实验组大鼠再灌注12 h、24 h、72 h時海马区神经元凋亡数量均较模型组减少，且认知功能亦有所改善，表明姜黄素在一定程度上可以减轻脑缺血再灌注损伤SH大鼠的神经元凋亡程度，促进大鼠神经功能的恢复，因此认知功能得以改善。PI3K/AKT信号通路是细胞存活的重要的信号通路，也是引起缺血再灌注后细胞凋亡、氧化应激等过程的通路[14-15]，本研究结果中，模型组海马区PI3K、p-AKT和Caspase-3蛋白表达量增加，表明脑缺血再灌注后激活了海马区PI3K/AKT信号通路，进而起到神经保护作用，而姜黄素的干预可进一步活化该信号通路，降低Caspase-3凋亡蛋白的表达，表明姜黄素可通过减少海马区神经元凋亡，增强对大鼠海马区的保护作用;但是否存在其他的神经保护机制仍需进一步的研究。

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（2020-09-22收稿 责任编辑：苍宁）