补肾培元胶囊对非小细胞肺癌A549细胞MKK-7/JNK信号通路影响的实验研究*

李培勇 曾崎冈 戴勇 魏成功 老昌辉

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路在肿瘤细胞增殖分化、衰老凋亡等多样生物学活性方面起着枢纽作用，可作为恶性肿瘤分子治疗的前卫靶点[1]。丝裂原活化蛋白激酶-7（mitogen-activated protein kinase kinase-7，MKK-7）参与细胞炎症因子和应激刺激等信号通路介导的细胞应答，通过磷酸化JNK结构域而特异性激活JNK活性[2]，MKK-7/JNK通路直接影响肿瘤细胞的功能状态，但MKK-7作用复杂，其双向调控机制仍有待进一步阐述[3]。中医药防治非小细胞肺癌，特别是在疾病的终末期，可起到明显改善临床症状、缓解并发症等作用[4]。本课题组前期研究显示补肾培元胶囊临床治疗多种恶性肿瘤性疾病疗效显著，其药效机制与JNK信号通路有关[5]。本研究旨在从血清药理学维度探索补肾培元胶囊对非小细胞肺癌A549细胞抗增殖特性调控机制，为药物进一步开发提供实验结论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物 非小细胞肺癌细胞系A549细胞株，由广东省中医药工程技术研究院细胞库惠赠。实验动物：SPF级SD雄性大鼠，（200±20）g，购自广东省医学实验动物中心，质量合格证编号：No44007200048391。

1.2 药品试剂 补肾培元胶囊（简称BSPY，广东省中西医结合医院制剂室，批号：粤Z20070308）。5-氟尿嘧啶（5-FU，上海麦克林公司）；GlutaMAX™培 养 基、0.25% Trypsin-EDTA、胎牛血清（美国赛默飞公司）；JNK、MKK-7 Rabbit Polyclonal antidody（美国Proteintech公司）；JNK、MKK-7 Primer均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要仪器 Leica DMi8高速成像平台[徕卡显微系统（上海）贸易有限公司]；SmartSpec plus核酸蛋白测定仪、IQTM5型荧光定量PCR仪、电泳仪、半干转膜仪（美国伯乐公司）；低温离心机（美国IEC公司）；超净工作台（苏州中亚净化设备有限公司）；GUIGO-99-IID型超声波细胞粉碎机（上海桂戈科学仪器有限公司）。

1.4 细胞培养 非小细胞肺癌A549细胞以台盼蓝计数法显微镜下计数，加入含有10%胎牛血清和1%链霉素的GlutaMAX™ 培养基中，调整细胞数后于5%CO2、37 ℃、100%湿度下培养传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.5 含药血清的制备 含药血清制备方法参照课题组已完成的补肾培元胶囊含药血清相关动物实验方法[5-6]：健康大鼠10只，每天禁食10～12 h后，依据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表方法，人与大鼠等效转换系数为0.018，补肾培元胶囊每日口服剂量3.6 g计算，3.6 g×0.018=0.064 8 g/d，根据每只大鼠每天灌胃2 mL，得出药物浓度为0.032 4 g/mL。药物于每日灌胃前配制，连续给药14 d，灌胃2次/d，第14天晚上开始禁食不禁水，最后一次给药1 h后，予采用20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉，无菌条件下从腹主动脉采血，分离除菌后血清-20 ℃保存备用。另取健康大鼠10只，按上述给药操作方法给予等量生理盐水灌胃，余处理方法同上。

1.6 CCK8法检测补肾培元胶囊含药血清对体外培养肺癌A549细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的A549细胞采用GlutaMAX™培养基于96孔板中调整终浓度至5×105/mL，采取190 μL细胞/孔，分为空白对照组、阳性对照组和补肾培元胶囊含药血清组，均培养24 h。空白对照组加普通血清10 μL，阳性对照组加入50 μmol/L的5-FU 10 μL。补肾培元胶囊血清组分别加入10%、20%、30%的含药血清（均为10 μL），各组分别设3个复孔，置培养箱中继续培养24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃温育1 h后于酶标仪450 nm单波长处测定各孔吸光度（OD）值，并计算细胞生长的抑制率（IR）。重复实验3次，取平均值。

1.7 实时荧光定量PCR测定补肾培元胶囊含药血清对体外培养肺癌A549细胞JNK、MKK-7核酸表达影响 各组细胞培养72 h后，取胰酶消化后A549细胞，采用Trizol一步法试剂盒提取细胞总RNA，使用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度，将RNA反转录成cDNA，经聚合酶链反应，以GAPDH为内参，采用图像分析仪分析数据，运用公式2-△△Ct计算基因相对表达量。见表1。

表1 RT-qPCR检测基因引物序列

1.8 Western blotting测定补肾培元胶囊含药血清对体外培养肺癌A549细胞JNK、MKK-7蛋白表达影响 常规培养A549细胞，按实验分组干预72 h，提取蛋白，BCA法调整蛋白浓度，取50 μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳、转印后转移到PVDF膜上。将膜取出经封闭后一抗4 ℃过夜，二抗摇床恒温孵育后，ECL暗室曝光，经显影定影后采用E-Gel Imager Software采集图像。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件处理，实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 空白对照组A549细胞体外生长情况

图2 阳性对照组A549细胞体外生长情况

2 结果

2.1 细胞增殖抑制测定 补肾培元胶囊含药血清干预体外培养的肺癌A549细胞72 h后，随着药物血清浓度的增加，对A549细胞抗增殖作用呈现时间-浓度依赖改变，以30%BSPY组作用72 h时A549细胞形态变化最明显，此时镜下观察肿瘤细胞受损明显，细胞不规则样聚集，细胞间隙增大，活细胞数量降低，悬浮细胞增多，见图1～5。

图3 10%BSPY组A549细胞体外生长情况（给药72 h，100×）

图4 20%BSPY组A549细胞体外生长情况（给药72 h，100×）

图5 30%BSPY组A549细胞体外生长情况（给药72 h，100×）

2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 单因素方差分析结果显示，各给药组24、48、72 h细胞增殖抑制率与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），其中以给药72 h后最为显著。10%BSPY组24、48、72 h细胞增殖抑制率均低于阳性对照组（P<0.05）；20%BSPY组、30%BSPY组24、48、72 h细胞增殖抑制率均高于阳性对照组（P<0.05）。见表2。

表2 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞体外生长不同时间细胞增殖抑制率的影响[%，（）]

表2 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞体外生长不同时间细胞增殖抑制率的影响[%，（）]

*与空白对照组相比，P<0.05；△与阳性对照组相比，P<0.05。

2.3 JNK、MKK-7 mRNA表达测定 单因素方差分析结果显示，各给药组JNK mRNA表达与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，各给药组JNK mRNA表达水平均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组相比，除阳性对照组外，其余各给药组MKK-7 mRNA表达均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与阳性对照组比较，各给药组MKK-7 mRNA表达水平均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 JNK、MKK-7蛋白表达测定 单因素方差分析结果显示，各给药组JNK蛋白表达与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；各给药组JNK蛋白表达水平与阳性对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。除阳性对照组外，其余各给药组MKK-7蛋白表达与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表3 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞JNK、MKK-7 mRNA相对表达量的影响（）

表3 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞JNK、MKK-7 mRNA相对表达量的影响（）

*与空白对照组相比，P<0.05；△与阳性对照组相比，P<0.05。

表4 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞JNK、MKK-7蛋白表达的影响（）

表4 不同浓度补肾培元胶囊含药血清对A549细胞JNK、MKK-7蛋白表达的影响（）

*与空白对照组相比，P<0.05；△与阳性对照组相比，P<0.05。

3 讨论

MKK-7在肿瘤发生、发展过程中的作用重要，但其机制极为复杂，经原位杂交技术显示MKK-7主要分布于脑、肺和消化系统中，尤以肺上皮部分表达最高[7-9]。MKK-7特异性靶标JNK激酶而产生生物学效应，各种致癌因子往往通过MKK-7/JNK信号转导通路影响肿瘤细胞增殖、迁移特性，致使细胞周期受阻，进而使肿瘤细胞增殖分化功能受损[10]。目前研究认为MKK-7在肺癌模型中扮演的主要是肿瘤抑制因子的角色，因而MKK-7是抗癌屏障中至关重要的感应靶点之一[11]。MKK-7稳定表达时，癌基因c-myc、血管生成素等肿瘤细胞中呈高表达的癌性基因表达明显下调，表明MKK-7负性调节癌细胞增殖[12-13]。尽管如此，仍有研究结果认为MKK-7还同时具有致癌作用。在鳞癌患者肺组织中MKK-7的mRNA表达较正常肺组织上调显著，抑制MKK-7的表达可显著抑制肿瘤转移改变，其机制可能与阻碍下游JNK的磷酸化有关[14]。以上研究结论的不一致性结果提示MKK-7复杂的生物反应可能与JNK信号通路复杂性有关，其信号通路作用机制仍有待进一步阐述。

中医学认为肺癌属于“肺积”“痞癖”“咯血”等范畴，“邪积胸中，阻塞气道……邪既胜，正不得而制之，遂结成形而有块”，《杂病源流犀烛》中的这段病因病机的描述，极佳地阐释了肺癌的发生、发展与人身正气亏耗、邪毒搏结有关[15-16]。肺癌初起邪毒瘀滞，实证蜂起，虚损之候可较隐晦，若至肺癌晚期，邪毒毁正，肺脾肾多脏虚损，遏邪乏权，此时虚证凸显，耗气伤血，阴阳俱损，假如患者采取手术方法切除肿瘤，则术后肺癌患者也可由于手术致阳气虚弱，阳损及阴而阴阳俱损于后，肺脾肾三脏之气阴两虚、阴阳并损的见证则随之而至。课题组针对肺癌的病因病机特点，认为肺癌肾阳虚寒毒内盛的主要特点，以“热病属阳，阳邪易散易治，不死；冷病属阴，阴邪易伏，故令人不觉，久则变为虚寒，侵蚀脏腑而死”为主要理论指导，创制了补肾培元胶囊治疗肺癌等多种恶性肿瘤，临床获益显著[17-18]。补肾培元胶囊由熟地、肉苁蓉、核桃仁、冬虫夏草、党参、菟丝子六味药组成，方小精简而力专效宏，现代研究显示方中单味药物的有效成分均有抑制肿瘤细胞增殖等作用，因而补肾培元胶囊综合其中药味性用，温而不燥，补而不滞，扶正固元而调整人身之阴阳平衡，从而形成补而不滞、温而不燥、通补结合的药物特点[19-20]。

本实验研究发现，在阳性对照组的JNK与MKK-7表达上，MKK-7与JNK的mRNA、蛋白表达与MKK-7的mRNA、蛋白表达呈反向改变，当肺癌A549细胞增殖抑制时，MKK-7表达升高，而JNK表达下降，表明MKK-7作为抑癌表达因子，可通过抑制JNK信号通路从而抑制A549细胞增殖。采用补肾培元胶囊含药血清干预肺癌A549细胞后，A549细胞增殖受到明显抑制，其肿瘤细胞恶性细胞生长形态受到显著抑制。与空白对照组、阳性对照组相比，30%BSPY组的JNK mRNA、蛋白表达量降低最显著，其MKK-7 mRNA及蛋白表达量升高改变也最为显著，表明补肾培元胶囊的药效机制可能通过稳定表达MKK-7，从而活化MKK-7/JNK信号通路表达，最终起到抑制肺癌A549细胞增殖作用。

综上所述，本实验证实了补肾培元胶囊含药血清对肺癌A549细胞的抗增殖作用，其药效机制与调控MKK-7/JNK信号通路有关，对今后进一步开展补肾培元胶囊调控MKK-7/JNK信号途径的深层次调控表达效应机制具有重大的临床意义。