HPLC法测定蒙成药萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A的含量

李玉华 姜楠 李景清 安文源

【摘 要】 目的：建立HPLC法测定蒙成药萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A的含量。方法：采用InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为用三乙胺调至pH（6.0±0.1）的甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），流速为1.0 mL/min，检测波长403 nm，柱温40 ℃，进样量为10 μL。结果：羟基红花黄色素A在0.03006～1.2024 μg范围内呈良好的线性关系，相关系数为r=0.9999;平均回收率97.38% （RSD=0.88%）。结论：所建立的HPLC法稳定可靠，可作为萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A含量测定的方法。

【关键词】 萨仁-嘎日迪;羟基红花黄色素A;HPLC;含量测定

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）22-0047-04

Determination of  Hydroxysafflor Yellow A in Mongolian Saren-Gridi by HPLC

LI Yuhua JIANG Nan LI Jingqing AN Wenyuan

Tongliao Institute for Food and Drug Control， Tongliao 028000，China

Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） for determination of Hydroxysafflor yellow A in Mongolian Saren-Gridi. Methods  The HPLC was carried out with InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， Using methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid solution （19.5∶1.5∶79）as mobile phase（PH（6.0±0.1）adjusted by triethylamine）at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The wavelength was set at 403 nm，the column temperature was 40℃，and the injection volume was 10 μL.Results The linear of  hydroxysafflor yellow A was in the range of 0.03006 μg～1.2024 μg （r=0.9999）.The average recovery was 97.38% （RSD=0.88%）.Conclusion This method is simple， high accuracy and specificity. It can be used for the determination of  hydroxysafflor yellow A.

Keywords：Saren-Gridi; Hydroxysafflor Yellow A;HPLC ;Content Determination

薩仁-嘎日迪由红花、黑云香、草乌、诃子、丁香、水银（制）、石菖蒲、木香、硫黄、白硇砂、苘麻子、白云香（枫香脂）、草决明、苏格木勒、草果仁、海金沙、方海、石膏、肉豆蔻、人工麝香、人工牛黄等二十一味药组成。具有消“粘”肿，燥“协日乌素”，祛“亚玛”等功效，用于治疗半身不遂，左瘫右痪，风湿骨痛，白喉，疮疡脓肿，鼻炎，偏头痛等症[1-2]。方中主药红花，性温，味辛，具有散瘀止痛、活血通经、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳等多种生理活性[3-5]。作为临床常用的蒙药医院制剂，萨仁-嘎日迪疗效确切，未见任何不良反应发生。但目前为止，该成药质量标准还停留在1984年版《内蒙古蒙成药标准》阶段，只有简单的外观性状和检查项目[6]。以红花中主要活性成份羟基红花黄色素A为指标，建立萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A含量测定的方法，能有效控制该成药的内在质量，为该成药质量标准的提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪（四元梯度泵，二级管阵列检测器，Empower色谱工作站），Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪（紫外检测器，LabSolution工作站），92SM-202A型电子天平，XS3DU电子天平，KQ5200DE超声波清洗机。

1.2 试药 对照品羟基红花黄色素A（批号：110637-201810，含量93.1%）由中国食品药品检定研究院提供;水为高纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。4批萨仁-嘎日迪医院制剂来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7-9] InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为用三乙胺调至pH*6.0±0.1）的甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），流速为1.0 mL/min，检测波长403 nm，柱温40 ℃，进样量为10 μL。记录时间20 min，理论板数按羟基红花黄色素A峰计算，应不低于4000。

2.2 对照品、供试品溶液及阴性对照品的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品7.514 mg，置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1503 mg/mL的羟基红花黄色素A对照品贮备液。精密吸取该对照品贮备液2 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，摇匀，即得羟基红花黄色素A（30.06 μg/mL）对照品溶液。

取样品粉末（过四号筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 Hz）30 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液经 0.45 μm 微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。

取处方中除红花以外的二十味药材，粉碎成细粉，按处方比例称重，其中人工麝香、人工牛黄需与其它药材细粉配研，所有药材粉末混合均匀，过筛，凉开水泛丸，银朱包衣，打光，干燥，即得阴性对照品。

2.3 专属性试验 取按处方比例制备的不含红花药材的阴性对照品，按“2.2”项下供试品溶液制备法制得阴性对照品溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照品色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性强，其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。色谱图如图1所示。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下羟基红花黄色素A对照品贮备液（0.1503mg/mL）200、1000、2000、4000、6000、8000 μL，置于10 mL量瓶中，用25%甲醇稀释定容后得到3.006、15.03、30.06、60.12、90.18、120.24 μg/mL系列浓度的对照品溶液。精密吸取上述各梯度浓度的对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积Y为纵坐标，相应的对照品的量X为横坐标，得到羟基红花黄色素A回归方程为：Y=34186X，r=0.9999。表明羟基红花黄色素A在0.03006～1.2024 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 按“2.2”项下供试品溶液配制方法，精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品2.0115 g，按“2.2”项下供试品溶液制备法配制成精密度试验溶液，精密吸取该溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。重复进样6次，测得峰面积的RSD值为0.64%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品2.0053 g，按“2.2”项下方法配制供试品溶液，精密吸取该溶液10 μL，分别于0、2、4、6、12、24 h注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。结果24 h内峰面积的RSD值为0.93%，表明该方法提取的样品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验 精密称取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品6 份，每份约2.0 g，按“2.2”项下方法配制供试品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算含量。结果6份平行样含量平均值为0.3711 mg/g，RSD为1.15%。表明该方法重复性良好。

2.8 加标回收率试验 取已测得含量的样品（扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128，含量为0.3711 mg/g）9份，每份约1.0g，每三份一组，精密称定，置具塞锥形瓶中，再精密加入羟基红花黄色素A对照品贮备液（0.1503 mg/mL）1250、2500、3750 μL，按“2.2”项下供试品溶液配制方法，配制成高、中、低3个浓度的加标回收溶液，精密量取各加标回收溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表2。3个浓度加标回收率平均值为97.38%，RSD值为0.88%。

2.9 色谱柱、仪器设备的耐用性试验 换不同厂家、不同型号的色谱柱及不同的液相色谱仪，取扎鲁特旗蒙医院制剂室提供，批号为20190128的2号样品，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取该样品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中羟基红花黄色素A含量。结果见表3。从表中数据可以看出，羟基红花黄色素A含量变化不大（RSD为1.05 %），表明该方法对不同色谱柱和仪器设备耐用性良好。

2.10 样品含量测定[10] 分取4个厂家提供的萨仁-嘎日迪样品粉末约2.0g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液制备方法提取制备样品溶液，精密吸取各样品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，测定结果见表4。

从表4数据可以看出：不同医院制剂室提供的4批成药中，羟基红花黄色素 A 的含量存在着明显的差异。考虑到所用的红花药材之间的含量差异，同时对各批成药相对应的红花原药材的含量进行了测定，计算出各批成药中羟基红花黄色素A的转移率。结果见表5。

表5中数据显示，不同制剂室生产的4批成药中，萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A的平均转移率在75.5%～100.0%之间。参考《中国药典》2015 年版一部“红花”含量测定项下规定含羟基红花黄色素 A 量不得少于 1.0%[8]，结合各批成药的平均转移率，暂定本品每1 g含红花以羟基红花黄色素A（C27H32O16）计，不得少于0.33 mg。

3 讨论

参照《中国药典》2015[6]年版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法[8]，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26∶2∶72）为流动相，结果目标峰羟基红花黄色素A拖尾因子1.49，拖尾严重，调整流动相比例甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），并用三乙胺調至pH（6.0±0.1），此时目标峰羟基红花黄色素A拖尾因子1.102，与其它干扰组分分离较好，保留时间适宜，理论塔板数较高。故作为检测流动相。

成药粉末以25%甲醇作为提取溶剂进行超声提取（功率120 W，频率40 kHz），为保证被测成分提取完全，实验中考察了超声提取40、50、60 min不同超声提取时间对提取效率的影响，结果羟基红花黄色素A的含量基本一致（RSD 0.51%），故提取时间定为40 min。

通过专属性，精密度，稳定性、重复性试验，色谱柱及不同仪器设备的耐用性考察，结果表明该方法准确可靠，可作为萨仁-嘎日迪中羟基红花黄色素A含量测定的方法。

参考文献

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（收稿日期：2021-04-06 编辑：陶希睿）

基金项目：内蒙古自治区蒙医药标准化项目（2019-MB022）。

作者简介：李玉华（1971-），女，蒙古族，硕士，研究方向为药品检验。E-mail：ambaby@vip.163.com