基于cpDNA单倍型多态性的草果栽培地理起源证据

赵小丽 杨耀文 李国栋

摘 要：  为了探索草果（Amomum tsaoko）的栽培地理起源，该文检测了草果、拟草果（A. paratsaoko）的cpDNA序列变化，并获取了单倍型多态性信息。结果表明：（1）20个草果居群272个植株、5个拟草果居群62个植株共检测到7种单倍型。其中，草果有3种单倍型（H1、H3、H6），拟草果有6种单倍型（H1、H2、H3、H4、H5、H7）。H1和H3为共享单倍型，H6为草果私有单倍型，H2、H4、H5、H7为拟草果私有单倍型。H1为普通单倍型，H2为祖先单倍型。（2）草果居群遗传多样性远小于拟草果居群，遗传变异主要来源于居群内，拟草果居群主要来源于居群间。麻栗坡铁厂（TC）、屏边玉屏（YP）居群的遗传多样性、单倍型多样性高于其他18个草果居群。（3）进一步分析表明，包含屏边、马关、西畴、麻栗坡的云南东南部前端地域和邻接的广西那坡可能共同构成草果栽培驯化起源中心，以麻栗坡为核心区域，向周边的西畴、马关、屏边、那坡扩张。因此，结果显示应对TC、YP、那坡下华（XH）居群加以保护。该研究结果为草果种质资源保護、利用提供了遗传学信息。

关键词： 草果， 拟草果， 单倍型， 多态性， 栽培地理起源

中图分类号：  Q941

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）12-2004-10

收稿日期：  2021-01-26

基金项目：  国家自然科学基金（81660631）;云南省应用基础研究—中医联合重点项目（2018FF001-010）;云南省应用基础研究-中医联合专项项目（2017FF116-004）;重大科技专项（2018ZF010-1）[Supported by the National Natural Science Foundation of China （81660631）; Key Fund for Traditional Chinese Medicine Cooperation of Application Fundamental Research in Yunnan Province（2018FF001-010）; Special Fund for Traditional Chinese Medicine Cooperation of Application Fundamental Research in Yunnan  Province（2017FF116-004）; Major Science and Technology Projects（2018ZF010-1）]。

作者简介： 赵小丽（1994-），硕士，中药士，主要从事药事管理、药事服务及临床药学研究（E-mail）2407560335@qq.com。

通信作者：  李国栋，博士，副教授，研究方向为中药资源保护与利用，（E-mail）gammar116@163.com。

Evidence for geographical origin of domestication of

Amomum tsaoko （Zingiberaceae） based

on polymorphism of cpDNA

ZHAO Xiaoli1，2， YANG Yaowen1，  LI Guodong1*

（ 1. Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. The People’s Hospital of Dehong Introduction， Mangshi 678400， Yunnan， China ）

Abstract：  In order to investigate the geographical origin of domestication of Amomum tsaoko， two hundreds and seventy-two individuals were sampled to represent 20 populations of A. tsaoko， and sixty-two individuals of five populations of A. paratsaoko were sampled as a related species materials. For acquiring genetic diversity informations， the sequence variations of their cpDNA were carried out. The results were as follows： （1） Seven haplotypes by the combined sequences were detected， i.e. three haplotypes （H1， H2 and H3） were found in A. tsaoko populations， and six haplotypes （H1， H2， H3， H4， H5 and H7） were found in A. paratsaoko populations. Two haplotypes （H1 and H3） were shared by the two species. H1 was common haplotype， H2 was ancestral haplotype and H6 was specific haplotype to A. tsaoko， while H2， H4， H5 and H7 were specific to A. paratsaoko. （2） The genetic diversity of A. tsaoko was lower than that of A. paratsaoko and mainly existed within populations. The genetic diversity of A. paratsaoko mainly existed among different populations. The genetic diversity and the haplotype diversity （Hd） of the two populations （TC and YP） were all higher than other 18 populations of A. tsaoko. （3） Further analyses indicated that the domesticated region of A. tsaoko would include Maguan， Xichou and Malipo， where at the front area of southeast Yunnan， and the area near Napo， Guangxi， China. Malipo would be the core domestication of A. tsaoko in the region， then the related area would expand to Xichou， Maguan， Pingbian and Napo. TC， YP and XH populations were proposed to protect their genetic diversity. The results of the two species were expected to provide genetic information and theoretical reference for protection and utilization of the germplasm resources.

Key words： Amomum tsaoko， A. paratsaoko， haplotype， polymorphism， geographical origin of domestication

草果（Amomum tsaoko）果实入药，味辛性温，具有温中健胃、消食顺气、祛寒湿的功能（中国药典委员会，2020），也被常作辛香料添加于食物中。草果主产于中国云南，在越南亦有分布（Wu & Raven，2000）。中国云南的栽培历史悠久，截至2004年，种植面积和产量均占全国的90%以上（明建鸿和胡耀华，2004）。目前，草果的栽培起源尚未明确，而草果产业发展需要亟待解决其产量和质量低下的问题。通过阐明草果的栽培起源，认识其栽培驯化后的遗传结果，有利于瞄准优良种质资源并提高品質。

Xia et al.（2004）研究表明豆蔻属（Amomum）是一个并系类群，属下的草果、拟草果（A. paratsaoko）和姜味砂仁（A. coriandriodrorum）共同组成一个单系。拟草果是草果亲缘关系最近的同属野生植物，它们的果实光滑、唇瓣顶端全缘而薄。前期资源调查、样品采集中发现云南文山州、红河州等草果传统产区通常有野生拟草果植株伴生，果实偶有混入草果，是草果药材的混淆品。但是由于它们种子挥发油成分不同，不能当作同一药材（徐国钧，1997）。广西那坡规六村（原属下华乡，后并入百省乡）邻近村1968年采收周围野生拟草果果实育苗种植，果实食用。在海拔≥1 200 m的地方，草果结果较多;在海拔900 m的地方，草果开花多，结果极少或基本不结实，而拟草果大量结果。干旱、光照多或少，草果生长不好或死亡，而拟草果都生长很好。草果果实成熟后不脱落，拟草果果实较小，成熟后脱落而腐烂。姜味砂仁因根茎、叶、果实有芫荽的味道（Wu & Raven，2000）而易于识别，前期研究未发现在草果居群周围有分布。因此，研究中将拟草果作为外类群。

居群分化过程是一个遗传和系统发生的过程。一个物种现有的居群结构不仅能反映目前基因交流的模式，也能反映谱系分隔的历史，而阐明居群分化过程是研究进化多样性的基础（Kenneth & Barbara，1999）。植物cpDNA具有分子量小、结构简单且多拷贝的特性，在大多数被子植物中，cpDNA为单亲母系遗传，有自己独立未被干扰的进化历史，可用于追溯植物起源和迁移历史;且cpDNA为单拷贝基因，后期PCR扩增、测序和序列分析的可行度较高（Badenes & Parfitt，1995;Petit et al.，2005）。探索植物cpDNA序列变化获得物种演化信息，可搭建联系居群水平的分化过程与宏观进化的系统地理学关系之间的桥梁。因此，我们利用草果、拟草果cpDNA的序列变化，试图探寻草果的栽培地理起源，以期为草果种质资源的保护、利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采自中国云南、广西，以及越南河江（表1，图1），凭证标本存于云南中医药大学。8个草果居群（LC、HS、SD、TBG、LJ、TY、ZH、JX）无拟草果伴生，TBG种源自越南经缅甸而来，其余7个由当地供销社在20世纪从云南文山州、红河州引种栽培。每个草果居群随机选取7～26个植株，植株之间相距≥5 m;生长在草果居群周边（直线距离≤200 m）的全部拟草果植株为一个居群，悉数采样。每一植株选取健康叶片，置于含硅胶的密封袋中干燥，并于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 仪器与试剂

PCR扩增仪（BIO-RAD C1000）、常温离心机（Eppendorf，Centrifuge 5415D）、凝胶电泳仪（BIO-RAD，Power Pac Basic）、凝胶成像系统（BIO-RAD，Universal HoodII）。植物基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克，DP3112）、PVP-40、EDTA、Tris、Taq PCR等。

1.3 总DNA的提取

采用改良植物基因组DNA快速提取试剂盒提取总DNA。对试剂盒说明书操作步骤稍做改动，加入Buffer P1和RNase后水浴30 min。DNA洗脱时分2次加入EB洗脱液，依次为30、20 μL。1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将提取出的DNA存于-20 ℃冰箱，备用。

1.4 引物的筛选

依据文献初步筛选出5对cpDNA序列（表2）。其中，trnHGUG-psbA、rps16F-rpsR与trnL-trnF序列能更好地扩增材料总基因组DNA，且PCR产物双向测序结果较好。

1.5 PCR扩增

扩增体系：总体积为25 μL。其中，Taq DNA聚合酶（1.0 U·μL-1）12.5μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，DNA模板（30 ng·μL-1）1 μL，ddH2O加至25 μL。扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s;64 ℃退火30～40 s，72 ℃延伸40 s，循环33次;72 ℃延伸6 min。产物存-4 ℃冰箱，送上海生工（Sangon Biotech）双向测序。

1.6 数据分析

利用GenesCode Sequencher 5.4.5软件拼接测序所得的双向序列，及ClustalX 2.0.10（Larkin et al.，2007）自动排列比对，结果导入Bioedit 7.05软件（Hall，1999）手工校对调整，矩阵中有系统发育信息的空位（Gap）按照插入缺失简单编码方法编码（刘杰，2011）。

1.6.1 序列变异与单倍型分布 利用Bioedit 7.05软件分别将比对完成的3个序列的两端切平，统计每一序列长度。MEGA 7.0.14软件确定3个序列中碱基G+C含量、特异变异位点、矩阵中包含的碱基插入/缺失情况。利用DnaSP 6.10.01分别计算3个序列核苷酸多态性（nucleotide diversity， π）、单倍型多样性（haplotype diversity，Hd）（Nei & Tajima，1981;Borowsky，2001），以及单倍型在居群中的分布。

常用参数 π和 θ可以衡量核苷酸多态性（Nei & Li，1979;刘杰，2011）。基于软件Network 5.0.1.0中值连接法（Median-joining network），利用最大简约标准对所有单倍型序列进行种内谱系的单倍型网络分析，之后结合采样点经纬度信息将居群单倍型分布以及共享情况利用Adobe IIlustrator CC 2019绘制成单倍型地理分布图。

1.6.2 居群遗传多样性与遗传结构分析 利用PermutcpSSR 1.2.1计算物种总的遗传多样性（HT）、平均遗传多样性（HS）。联合每一个体的3个序列拼接结果，利用Arlequin version 3.5.1.2检测居群遗传结构。

1.6.3 邻接系统进化树构建 利用MEGA 7.0.14软件的系统发育模块（phylogeny）构建NJ邻接树（neighbor-joining tree）。基于Kimura 2 - parameter（K-2P）模型和自举法（bootstrap method）计算居群对之间的平均遗传距离（compute between group mean distance）;自举法重复次数（replications）设置为1 000;替换包括（substitutions to include）设置为“d：过渡+横向（d：Transitions+Transversions）”;位点之间的速率（rates among sites）设置为统一速率（uniform rates）;差距/缺失数据处理（gaps/missing data treatment）设置为完全删除（complete deletion）。

2 结果与分析

2.1 序列特征和单倍型检测

3个序列G+C含量在29.6%～32.7%之间，符合叶绿体GC含量低的特点（孙果丽，2015）。3个序列均有碱基插入/缺失，π 与 θ 的值均小于0.01。联合序列对齐后的长度为2 258 bp，多态性信息位点为66个，共有18个碱基的插入/缺失（表3）。将联合片段应用于单倍型检测，依据碱基的插入/缺失、替换得到7种单倍型（表4）。

2.2 单倍型在草果和拟草果中的分布及其关系

H1分布最广，为普通单倍型;H2和H4的个体数极少，为稀有单倍型;H6仅分布于XH居群，H4、H5、H7分别分布于RHy、TCy、YPy居群（表5）。TC、YP居群各有2个单倍型;综合观察，云南麻栗坡（TC、ML、TCy）检测到4种单倍型，为单倍型类型最丰富的地区，其次是西畴（FD1、FD2、FDy）、屏边（YP、YPy）、那坡（XH、BSy），均有3种单倍型（表1，表5，图1）。云南麻栗坡、西畴、屏边属于滇东南小区，为红河和哀牢山以东的云南南缘地带（吴征镒和朱彦丞，1987），邻接广西那坡。

H2位于网络图的中央位置，可能表明其为祖先单倍型;H2与H3、H4之间亲缘关系较远，H3和H4需要经过三次突变才能得到H1;H4、H5、H6均由H2分别经过一步突变而来，它们与H2的亲缘关系较近，又和H7共同聚为一支（图1）。这表明H2、H4、H5、H6、H7是较原始的单倍型，而与它们关系较远的H1、H3是衍生的单倍型。因此，结果认为TCy、FDy是在本研究系统中较为原始的居群，它们都具有祖先单倍型H2。比较H5、H3与H2亲缘关系的远近，TCy可能比FDy更为原始，更接近祖先居群。RHy、BSy、XH可能也是比较原始的居群，它们分别具有与祖先单倍型亲缘关系较近的单倍型H4、H5和H6。因此，云南麻栗坡、西畴、马关和广西那坡可能是草果的栽培起源中心，而麻栗坡（铁厂）可能是这一中心的核心区域，向周边的西畴、马关、屏边、那坡扩张。

H1、H3在拟草果和草果中共享，H1主要发生在草果居群，19个草果居群均有H1，拟草果仅BSy的4个植株有;H3主要集中在FDy，在草果居群仅YP的2个植株、TC的4个植株有。这反映H1和H3发生在草果栽培驯化之前，栽培驯化后祖先遗传多态性在两个世系（谱系）中的分选和保持。H6经由H2一步突变而来，可能是一个古老单倍型，发生在栽培驯化之前。H6经一步突变后得到H7，H7仅存于YPy（图1），且频率不高（4.67%），与H6的频率（5.06%）接近（表5）。因此，H6可能在拟草果中绝迹了，或是在样品采集中遗漏了。此外，草果的3个单倍型（H1、H3、H6）源于拟草果的单倍型H2、H4。

2.3 遗传多样性和遗传结构

草果20个居群272个植株共检测到3种单倍型，占单倍型种类的42.86%，占植株数量的1.10%。拟草果5个居群62个植株共检测到6种单倍型，相应数值为85.71%和9.68%。2个共享单倍型占草果单倍型频率的92.46%，相应地仅占拟草果的24.14%（表5）。这说明拟草果遗传多样性高于草果。

草果居群的單倍型多样性指数（Hd）和核苷酸多样性指数（π），18个居群均为0，TC最高，其次是YP，说明这2个居群遗传多样性高于其他18个居群。FDy有两种单倍型，Hd、π值最高，遗传多样性最高;遗传多样性较高的还有BSy和TCy。大多数草果居群遗传多样性都比较低，拟草果居群遗传多样性较高（表5）。因此，云南麻栗坡、西畴、屏边、马关和广西那坡可能是草果、拟草果遗传多样性中心，也可能是草果栽培起源中心。TC、YP的遗传多样性高于其他18个草果居群，说明它们经历的人工选择较小，从而保留了较多的遗传多样性，更接近祖先居群。因此，云南麻栗坡、屏边很可能是草果的栽培起源中心。

草果、拟草果居群遗传多样性检测表明，草果居群总的遗传多样性HT=0.121，居群内平均遗传多样性HS=0.022，核苷酸多态性π =0.001 52，居群间遗传分化系数FST=0.419 15;而拟草果居群HT=0.963、HS=0.246、π=0.008 52、FST=0.715 21;草果居群的遗传多样性和遗传分化程度远小于拟草果居群。AMOVA分析，草果居群的遗传变异主要来源于居群内（58.08%），拟草果居群主要来源于居群间（71.52%）;居群间的遗传分化程度，草果（FST=0.419 15，P<0.01）远小于拟草果（FST=0.715 21，P<0.01）（表6）。

2.4 居群系统发育关系和草果栽培起源分析

3个cpDNA序列联合后，构建了20个草果居群与5个拟草果居群间的系统发育关系， 所有分支支持率均大于50%。FDy单独聚为一支，与其他24个居群的亲缘关系较远。种间水平上草果与拟草果各自分支;除XH外，草果19个居群聚为一支，且没有进一步的分支。4个拟草果居群，YPy、TCy、BSy聚为一支，RHy单独聚为一支（图2）。与草果相比，拟草果则有明确的拓扑结构，并且有较高的支持率。一方面再次佐证草果种质来源较为均一，另一方面也提示基于单亲遗传的trnHGUG-psbA、rps16F-rps16R与trnL-trnF序列联合片段的变异多态性分析结果未能有效揭示草果居群遗传结构、栽培驯化过程中的动态变化情况。

XH与拟草果聚为一支，并与YPy聚为一小支，提示XH与YPy的亲缘关系最近，其次是与TCy、BSy亲缘关系较近。H6只在XH中发现，H6与H2亲缘关系较近。这提示XH是与拟草果亲缘关系最近的草果居群，也是一个较原始的、遗传结构较接近祖先居群的草果居群，这与依据单倍型网络关系图推导的结论一致。因此，广西那坡可能是草果的一个栽培起源中心。基于拟草果和草果的系统关系（Xia et al.，2004），以及YPy、TCy、BSy与草果居群的亲缘关系较近，屏边玉屏、麻栗坡铁厂、那坡百省可能也是草果的栽培驯化中心。

RHy单独聚为一小支，提示该居群可能比YPy、TCy、BSy拥有更早的进化关系;该居群独有H4，H4分别经过3次突变可得到H1、H3;而且H4是连接祖先单倍型H2和草果普通单倍型H1的桥梁。因此，马关可能也是草果栽培起源中心。FDy单独聚为一支，它是唯一既有祖先单倍型H2，又有衍生单倍型H3的拟草果居群，这可能是与其他24个居群亲缘关系较远的原因;H3又为共享单倍型。因此，西畴法斗可能是草果栽培地理的起源中心。

3 讨论与结论

单倍型网络关系图提示草果的3种单倍型没有完全集成一个单系，H1和H3分布于网络图的一端，私有单倍型H6混在拟草果单倍型之中。因此，7个单倍型的谱系关系和物种没有明显联系，可能是祖先遗传多态性在两个世系（谱系）中分选、保留的结果，也可能存在基因流。草果、野草果（A. koenigii）间人工杂交已有成功报道（崔晓龙等，1995a），草果和拟草果间未见报道。种间基因渗入只发生在同域物种之间（Kenneth & Barbara，1999）。YP和YPy有植株混杂，并无共享单倍型;XH和邻近的BSy无共享单倍型;FDy与FD1、FD2相邻也无共享单倍型。这说明自然状态下草果与拟草果之间没有基因渗入，也可能是样本少的缘故（草果：40株，拟草果：25株）。

人类农业起源没有超过1万年（Kenneth & Barbara，1999），因此，草果栽培起源是一个距今时间较短的事件。H1、H3在拟草果和草果中共享，推测它们可能发生在草果栽培驯化之前，而栽培驯化后祖先的遗传多态性则在两个世系中进行分选和保持。目前认为豆蔻属起源于喜马拉雅，通过南亚向澳大利亚北部扩散，一直延伸到太平洋中部（Kiew，1982;Smith，1985）。而豆蔻属是起源、分化历史不久远的类群，也支持了拟草果和草果是新近分化的物种。拟草果是草果亲缘关系最近的同属野生植物，系统发育分析中又共同构成单系（Xia et al.，2004），它们可能有新近的共同祖先。有新近共同祖先的物种间发生谱系分选的可能性很大（Nevo & Karlin，1986;Wu，1991）。因此，基于单亲遗传的trnHGUG-psbA、rps16F-rps16R与trnL-trnF序列联合片段的变异多态性分析结果，除了单倍型H6，草果单倍型是拟草果单倍型的子集。草果栽培驯化过程反映了祖先遗传多态性在世系间的分选、保留。19个草果居群都有H1，有H1的草果植株可能在早期栽培中农艺性状表现较好，例如，成活率较高、繁殖力较强、果实产量较高等优势而容易被选择保留。和其他栽培植物一样，在长期栽培驯化过程中，这样的人工选择会导致遗传多样性的大量丢失。

草果在各地之间相互引种栽培，又存在以老株分化替代、发展新株的繁殖方式（崔晓龙等，1995b），导致个体遗传背景、居群种质趋于均一化。草果在长期的栽培驯化中可能经历了较强的人工选择压力，从而引发高频率等位基因的有效固定和低频率等位基因的严重丢失，最终导致遗传多样性严重丢失，遗传背景愈加狭窄化。与拟草果居群相比，也可说明草果栽培驯化过程中遗传多样性大量丢失的事实。栽培植物遗传多样性的减少似乎是栽培植物和野生近缘植物系统（crop-relative systems）中的一个规律（Doebley，1989;Hecht，1993;Tanksley & McCouch，1997），反映了在栽培驯化过程中人工选择、建立事件（founder event）导致的遗传漂变致使栽培植物遗传多样性减少（Ladizinsky，1985;Doebley，1989;Eyre-Walker et al.，1998）。這种模式也提示拟草果和草果之间是祖先-衍生者关系（progenitor-derivative relationship）。当然，栽培植物与其近缘植物之间的遗传多样性变化反映了许多互相作用的进化因素而难以简单评价（Doebley，1989）。

基于草果、拟草果的系统关系，2个共享单倍型发生在FDy和BSy，提示西畴法斗、那坡百省可能是草果栽培地理起源中心。从草果单倍型多样性、居群遗传多样性的角度，可考虑加入屏边玉屏和麻栗坡铁厂;从拟草果单倍型多样性的角度，可考虑加入马关仁和;结合居群系统发育关系分析，由屏边（玉屏，大围山范围内）、马关（大围山范围内）、西畴（法斗）、麻栗坡（铁厂）组成的这个云南东南部的前端地域，和邻接的广西那坡（下华，属百省乡）共同构成的这一区域可能是草果栽培驯化的地理起源中心。这一结论与毛品、冯国楣先生早期的草果采集记录吻合，他们分别采集于屏边、西畴，童绍全采集于马关、麻栗坡（童绍全，1998）。草果大量引种发生在20世纪70年代末至80年代，由各地供销社组织引种。麻栗坡（铁厂）可能是这一中心的核心区域，以麻栗坡为核心区域，向周边的西畴、马关、屏边、那坡扩张。这一结论可为草果核心种质构建、种质资源收集和保护，以及种植模式和栽培管理的研究提供一定的遗传学依据。

在長期栽培驯化过程中，草果遗传多样性大量丢失，造成现有遗传资源单一化，表现为草果居群遗传多样性远小于拟草果居群，草果居群遗传变异主要来源于居群内，而拟草果居群主要来源于居群间。TC、YP这2个草果居群的遗传多样性、单倍型多样性高于其他18个草果居群;而XH具有草果私有单倍型，建议对它们加以保护和利用。FDy是研究系统中遗传多样性最高的居群，为促进草果质量和产量的提高而储备野生种质资源，对FDy深入研究、保护、利用可能对草果产业的发展有重要的意义。

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（责任编辑 何永艳）