丛枝菌根修复煤矿废弃地的机制与应用潜力

石 峰，宋福强

(1.农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2.黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，哈尔滨 150080)

0 引 言

煤炭开采是世界范围内的主要环境问题，在中国尤为重要，由于煤炭开采活动对土壤生态系统造成了相当的负面影响，因此煤炭开采活动一直引起极大的环境关注[1]。据统计，全国已形成2.88×106hm2的废弃地，现约以9.67×104hm2·a-1的速度继续扩大，大面积的废弃地毁坏了大片森林草原和农田，将生产性用地变成非生产性用地，除此还造成水土流失，使土地贫瘠化以及土地干旱化，从而使耕地急剧减少，同时对空气、水体、土壤造成污染，且这些污染将长期存在[2]。因此，对于煤矿废弃地污染的治理刻不容缓。

目前，一般采用表土剥离或挖高垫浅的混推方式对煤矿区土壤进行工程修复[3]。但工程复垦后的土壤结构严重破坏，上下土层错位翻动，裸露的表土层往往是原基底土层；土体紧，孔隙小，结构不良，通透性很差，植物根系难以定植；微生物活动微弱，丧失了原有土壤孔隙结构的保水保肥能力，而且土壤有机质和养分缺乏[4]。生物修复是近年来新兴的一种前景广阔的治理污染的技术[5]，其中微生物—植物联合修复技术具有成本低、抵抗力强等优点。丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌在自然界分布广泛，可以与80%的陆生植物形成共生体，是土壤微生物区系中与农业生产关系最为密切的一类真菌[6]。AM真菌通过借助宿主植物光合固定的碳骨架和能量来完成自身的生长，同时发生营养元素的转化和运输，最终传递给宿主植物供其利用，增强其抗逆性[7]。AM真菌能够促进植物对土壤中氮、磷、钾等元素的吸收，改善植物的营养情况[8]。此外，AM真菌能够产生球囊霉素、有机酸等次生代谢物质，直接或间接地影响宿主植物及其根际环境，从而提高植物的修复效率[9]。因此运用AM真菌与植物联合修复技术在煤矿废弃地修复方向具有很大的前景。

国内外对应用AM真菌和植物形成共生体来修复煤矿废弃地进行了研究，但结果仍不完善并且缺少较大型的试验。本文主要讨论AM真菌对煤矿废弃地易造成的重金属污染、有机化学物质污染的修复作用以及增强矿区植物的生存能力，为AM真菌修复煤矿废弃地的后续应用提供科学依据。

1 AM真菌对煤矿废弃地植物生长的促进作用

1.1 AM真菌对采煤沉降区植物根系损伤的修复作用

我国90%的煤炭资源采用地下开采方式开采，造成地表沉陷环境破坏，采煤沉陷引起的地裂缝会使土壤结构退化，改变水分蒸散量，并对植物根系造成机械损伤[10]。采煤沉陷区植物根系的损伤是由多个外部因素综合作用的结果，这些外部因素包括受损根系处土壤含水量和矿物质元素的变化、植物根际微生物数量的减少及其和土壤酶内在联系的改变、植物根系所处不同坡位的塌陷、受损根系所处裂缝的宽度和落差、植物根系距裂缝的距离等。生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)为植物重要内源激素，也是植物响应逆境的最敏感组分，根系受损必然引起这些根系内源激素相应的变化。弄清楚根系损伤的的诱因是研究AM真菌修复植物根系损伤机制和机理的基础，目前对于AM真菌修复根系损伤，已经有了一定的研究和结果。

毕银丽等[11]发现AM真菌可降低根系损伤对内源激素分泌的影响，AM真菌在修复根损伤中具有一定的作用。孙金华等[12]将采煤沉陷区柠条作为宿主植物接种AM真菌，发现柠条株高、冠幅和地径显著提高；接菌柠条叶片可溶性糖含量和过氧化氢酶活性显著增加。Bi Y等[13]研究发现AM真菌显著提高了地上部和根生物量和N、P、K含量，增加了叶面积和叶绿素含量，增加了IAA、CTK水平，降低了根系ABA水平；此外，接种AM真菌摩西管柄囊霉改善了受地裂缝影响植物的激素平衡，有助于减轻根系对玉米生理和生长的损害效应。因此，AM真菌与矿区植物形成共生体，对增强矿区植物耐受力，促进其生长发育，改善矿区环境、恢复矿区植被具有重要的应用意义。

1.2 AM真菌改善矿区植物生存环境

煤矿废弃地土壤贫瘠，表现之一为土壤中各种元素缺乏和难以利用。磷是植物生长发育所必需的营养元素之一，土壤中能够被植物吸收利用的磷称为土壤有效磷[14-15]。当植物体内缺磷时，会使蛋白质的合成受阻，细胞质、细胞核的形成也受阻，进而影响细胞的正常分裂分化的同时还会使植物矮化、叶片变小，夜色暗绿缺少光泽等症状[16]。研究表明AM真菌能促进根际有机磷矿化，提高其生物有效性[17]。作为植物需求量最大的营养元素，氮素是陆地生态系统初级生产力的主要限制因子[18-19]。无机氮是植物的重要氮源，其中铵态氮和硝态氮是植物可以直接利用的两种主要氮源[20]。AM真菌可以使土壤中的有机氮分解为无机氮，供给植物吸收利用。相比于其它土壤氮素循环过程，固氮过程是一个被研究较多的过程，固氮促进了全球范围内土壤中氮素的累积。很多研究证明接种AM真菌可以增强豆科植物根瘤的固氮能力[21]。氮素在供体和受体之间的这种传递具有重要的生态意义，可以影响到植物之间的生长和竞争，进而维持生态系统的稳定。

同时AM真菌对不同养分元素活化具有特异性。芦笋接种摩西球囊霉(Glomusmosseae)后，显著提高了土壤中钾、镁、锰元素有效性，AM真菌增强了芦笋根系从土壤中吸收这些元素能力，而对于锌的吸收量却减少[22]。菌丝能进入根系不能进入的直径较小的土壤孔隙内，吸收毛管水和矿质营养。菌丝穿插进入土壤小孔隙中，显著增加土壤水稳性和大团聚体数量，改良土壤结构[23]。菌根分泌还原物质, 使Mn (Ⅳ) 还原至Mn (Ⅱ) ，增强矿物锰溶解和植物对其的吸收[24-25]。由此可见，AM真菌可以通过与植物形成的共生体来溶解土壤中难分解的矿质元素，改善矿区植物所处的土壤环境，使得植物更好的生长。

2 AM真菌对煤矿废弃地重金属污染的修复作用

煤炭资源的开采、加工和利用过程会引起土壤环境污染、地表塌陷等生态环境问题，对人居环境、人群健康、生态安全等产生重要影响，而重金属污染治理是煤矿废弃地修复的重要内容[26]。

2.1 AM真菌修复重金属污染的表现形式

AM真菌借助根外菌丝为共生宿主植物提供水分和无机矿物质营养，如磷素养分等，在促进植物生长发育、改善植物营养状况、增强植物逆境抗性、提高植物重金属耐性等方面起着重要作用[27]。杨玉荣[28]的研究表明，在铅污染土壤中接种AM真菌的刺槐植株中N、P、S和Mg元素含量较未接种植物有明显提高，说明AM真菌能改善植物养分吸收状况，从而促进植物生长。铀可以抑制蜈蚣草地上部的生长，而接种AM真菌能够减轻这一问题，说明AM真菌能够有效缓解铀毒害[29]。AM真菌可以通过调节植物对重金属的吸收和转运，从而有助于增强宿主植物对重金属胁迫的抗性[30]。AM真菌能够增加煤矸石绿化基质的可利用性营养物质含量，提高基质肥力，促进植物生长，在煤矸石绿化利用中具有重要的应用价值[31]。AM真菌能够增加煤矸石的速效磷钾、微生物量碳氮磷、根外菌丝长度，提高过氧化氢酶和磷酸酶活性，最终促进煤矸石的分解和绿化，木霉菌与丛枝菌根真菌混施后，进一步促进了煤矸石的分解和绿化，其中中剂量的木霉菌协助促进效果最好，使煤矸石分解率、紫花苜蓿的菌根侵染率和紫花苜蓿鲜重分别显著提高了37.98%，39.70%和39.77%[32]。Wu S L等[33]将蒲公英接种AM真菌，发现与未接种AM真菌相比，接种AM真菌显著降低了蒲公英根系和地上部的Cr浓度,降低了Cr对蒲公英的毒害影响。这些说明，AM真菌扩增后大规模地接种到植物体中可能是未来增强植物在煤矿重金属污染土壤中耐受性的应用之一。

在诸多研究报道中，对植物进行Cd处理，相当于对照组而言，接种AM真菌能够促进植物生长，植物的生物量以及氮、磷等营养物质的含量显著增加[34]。AM真菌还能够提高植物根系的Cd含量，降低地上部含量，减轻Cd对植物地上部的毒害。刘灵芝等[35]发现，Cd胁迫下AM真菌能够影响宿主植物对重金属的吸收转运，接种AM真菌的玉米根系中Cd浓度显著高于对照未接种AM真菌的玉米，地上部则情况相反，接种AM真菌的玉米植株地上部Cd浓度低于对照。Rask K A等[36]认为，在菌根化程度高的植物中，更能减少Cd向植物地上部的转运。即使在复合重金属胁迫条件下，AM真菌也能提高植物Cd积累能力[37]。由此可见，AM真菌在修复矿区重金属污染方面具有良好的效果和潜力。

2.2 AM真菌修复重金属污染的机制

AM真菌代谢产物增强植物对重金属污染的耐受性。球囊霉素可由绝大多数种的丛枝菌根分泌，并且能够与多种重金属结合，可促进重金属的迁移运输等过程，能够有效增加土壤有机碳库，改善土壤团聚体结构及性能。作为一种金属离子专性糖蛋白，特定的某些金属能与球囊霉素发生络合作用从而被固定。而某一蛋白的分泌与基因表达必然相关，可以联想丛枝菌根影响重金属迁移的原因之一是通过影响植物体内某些基因表达，促使植物体内能够和重金属特异性结合或固定重金属元素的物质分泌[38]。植物提取过程就是通过重金属相应地超富集植物转运该重金属的作用，将土壤中的重金属向植物地上部通常是茎部转运，通过对植物的收割及焚烧等方法去除重金属。一般情况下这种超富集植物不会是粮食作物，这样就避免了重金属进入食物链。

AM真菌能通过调控自身以及宿主植物抵御重金属污染的毒害作用。在紫花苜宿上接种根内球囊霉(Glomusintraradices)后，发现植物螯合素合成酶MsPCS1和金属硫蛋白MsMT2均下调，可能是因为Cd已被固存在根内细胞的真菌结构中，从而导致宿主植物紫花苜宿根细胞中Cd浓度降低[39]。Cd进入根内，细胞内的氧化还原平衡遭到破坏，产生活性氧基团，AM真菌能刺激植物激活自身的防御机制来抵御重金属的危害，通过提高植物体内一些抗氧化物酶的活性，达到清除自由基、避免对细胞造成伤害的目的，例如植物叶片过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等活性升高[40]。孙红[41]利用RNA-seq测序技术研究Cd胁迫下，根内根生囊霉接种柳枝稷后，AM真菌如何调节植物基因表达。通过试验发现，接种后的柳枝稷根系POD、SOD等抗氧化酶基因上调，表明胁迫条件下，植物体内活性氧基团累积引发氧化应激反应。当Cd进入到植物的组织或细胞后，植物会产生相应的配体螯合剂，螯合Cd并将Cd固定在植物的根细胞质或液泡内，对Cd起到“区室化隔离”的作用,避免细胞器与Cd接触，达到对Cd降低毒性或者解除毒性的目的，这类螯合剂包括植物络合素(phytochelatins,PCs)和金属硫蛋白(metallothioneins,mMTs)等[42]。目前对于AM真菌修复重金属污染的机制方面有了充足的研究，修复机制和修复机理也较为清晰，这为AM真菌修复煤矿废弃地重金属污染提供了理论基础，表明了AM真菌具有修复煤矿废弃地污染的潜力。

3 AM真菌对煤矿废弃地有机化学物质污染的修复作用

我国煤炭资源开采以井工矿为主，为了保证井下的安全生产，必须排出大量矿井水[43-44]。常规的矿处理工艺可以去除水中大部分污染物，但是油类等有机污染物则难以去除(特别是溶解性有机污染物)[45]。这些污染物的排放在污染水体的同时也污染土壤。土壤的有机污染主要包括石油污染、多环芳烃类 (Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs) 污染、多氯联苯类 (Polychlorinated Biphenyls，PCBs) 污染等。这些物质残留于土壤中，不仅影响了土壤正常的结构和功能，抑制了植物的生长，还能通过食物链的传递进入人体，引起生殖系统障碍和内分泌系统失调，有些甚至具有明显的致畸、致癌和致突变作用[46]。对此将从修复机制以及应用来介绍AM真菌对煤矿废弃地有机化学物质污染的修复作用。

3.1 AM真菌修复煤矿废弃地有机化学污染物的潜力

多氯联苯是一种典型的持久性有机污染物，具有化学稳定性、热稳定性、抗氧化性高及高疏水性，由于PCBs的高度持久性、生物累积性及潜在致癌性，因而受到更多的关注[47]。

在植物—AM真菌这一共生体系中，菌根作为真菌与植物的结合体，对土壤的影响具有微生物和植物的双重特性，不仅能从微生物修复角度改变土壤微生物种类和数量，影响有机降解，还能从植物修复角度通过改善根系的吸收面积、降低植物与土壤之间的质流阻力、促进根系对水分和养分的吸收和利用等方式来影响有机物的降解[48]。滕应等[50]在盆栽条件下研究了丛枝菌根真菌和苜蓿根瘤菌对PCBs污染土壤的联合修复效应，结果表明无论是单独还是同时接种均显著促进了土壤PCBs的降解率[49]。有研究结果表明，接种AM真菌与添加猪炭均表现出提高土壤PCBs降解率的趋势，其中，接种AM真菌同时添加大粒径猪炭的修复效果最为显著。秦华等[51]在对美国南瓜(Cucurbita pepo L.)接种不同AM真菌后发现，AM真菌提高根系生物量，促进微生物生长的同时，也提高了PCBs 的降解率，且根际土壤中降解率显著高于非根际土壤。有研究论证了丛枝菌根菌丝在不同多氯联苯同系物降解效率中的重要作用：通过细菌生长、BPH基因丰度和细菌群落组成的分析，显示了不同的土壤菌根菌丝生物量是不同的，支持了菌根菌丝可以通过改变菌根圈的细菌生长和群落组成来加速低氯联苯的消散的假设，并形成土壤多氯联苯的同系物剖面。由于AM真菌—植物共生在陆地生态系统中普遍存在，因此AM真菌对多氯联苯同系物消散的影响在陆地生态系统修复多氯联苯污染土壤中具有广泛的相关性，同时对煤矿废弃地有机化学污染物的修复具有很大的潜力。

多环芳烃(PAHs)是土壤中的持久性有机污染物，被美国环境保护局列为优先污染物，因其致癌和致突变特性而受到全世界的关注。杨振亚等[52]通过研究发现摩西球囊霉和层状球囊霉处理土壤中AM真菌菌丝密度、总球囊霉素含量均与土壤中菲和芘的去除率之间存在极显著正相关关系，表明接种AM真菌提高了土壤中AM真菌菌丝密度和总球囊霉素含量，并促进了土壤中PAHs的去除。研究表明，AM真菌可以促进植物在碳氢化合物污染土壤中的建立和存活，也有助于提高植物根际对碳氢化合物的生物降解率[53]。AM真菌利于南瓜转移根系吸收的高浓度PAHs化合物至地上部，降低PAHs对根系的胁迫,增强南瓜在高浓度PAHs污染土壤中存活[54]。 AM真菌在处理有机化学污染物方面已有了相当的研究，取得了较好效果，在修复煤矿废弃地有机化学污染物方面具有了理论基础和一定的实例，应用前景乐观。

3.2 AM真菌对有机化学污染物的修复机制

AM真菌对于有机化学污染物污染的修复机制分3个方面：

1) 修复植物生长面临的问题之一是土壤中碳氢化合物的疏水性限制了其对水分和无机养分的吸收。一些研究的结果表明，应用AM真菌可以克服这些困难[55]。AM真菌对非生物胁迫下植物生长产生的有利作用，是使植物根系抗氧化活性增强的结果。AM真菌的侵染可以提高被多环芳烃和石油烃污染的植物在水分胁迫和盐分胁迫下的酶和非酶抗氧化剂活性[56]。由此可知，AM真菌通过提高宿主植物的生长状态来提高植物对有机污染的修复能力。

2) AM真菌在清理碳氢化合物污染场地中的重要作用主要是通过AM真菌介导的根际降解来实现的，短暂的根外菌丝体扩大了根际的范围，从而形成了高磷层，为土壤微生物的活动和增殖提供了有利的栖息地[57]。在根的降解过程中，来源于微生物的酶和根系分泌物参与其中。后者除植物胞外酶外，还含有系列共代谢物，构成了负责有机污染物生物降解的微生物的碳和能量来源。促进多环芳烃降解的共代谢产物主要包括酚类化合物、溶解有机碳以及小分子有机酸[58]。在丝状层和菌丝层中，氧化还原酶活性较高，如脱氢酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、过氧化物酶以及超氧化物歧化酶等，这些酶主要负责多环芳烃的氧化转化和降解，此外，它们还保护植物免受氧化胁迫[59]。因此，丛枝菌根真菌通过介导的植物根际来降解有机污染物，以此修复污染土壤。

3) 由于高度疏水性，植物对多环芳烃的吸收和向地上部的转移是有限的，主要发生在根组织中。在根组织中，多环芳烃被控制在活细胞的亲脂性隔间，从而对细胞膜和细胞结构产生不利影响。Lenoir I等[60]证实，菌根侵染减少了多环芳烃在地上部的积累，根系对多环芳烃的吸收比未接种对照增加0.2%，此外，菌根组织中的总积累量占多环芳烃总量的6.6%，而生物降解的多环芳烃占总积累量的17.8%。多环芳烃既可被菌根吸收，也可被菌丝外真菌结构吸收，利用菌根植物的菌丝和菌丝—根室分离系统进行的实验表明，菌根中的多环芳烃主要被茎外菌根菌丝吸收，然后转移到根中[61]。所以，丛枝菌根真菌能够促进植物对多环芳烃的吸附和生物积累来修复土壤的有机化学物质污染。

4 结论和展望

丛枝菌根真菌在环境及农林领域都有着巨大发展的研究潜力，然而丛枝菌根真菌在大规模纯培养方面仍有较难的技术问题，因此如何将其大规模地应用于污染土壤修复是目前亟待解决的问题。考虑到丛枝菌根真菌对同种植物的侵染情况有所不同，同种丛枝菌根真菌对不同植物的侵染情况也各有不同，通过研究菌根侵染率可以有效提高丛枝菌根这一共生体修复重金属污染土壤的效率。

AM真菌辅助植物修复在清除碳氢化合物污染土壤方面显示出巨大的潜力，但要优化该方法并克服其局限性，还需要进行更全面的实验。尤其需要在多环芳烃混合污染的土壤上进行野外条件下的实验，因为实验室研究消除了一些环境因素，而且通常是在单一AM真菌物种和单一污染物的情况下进行的。AM真菌辅助植物修复的设计还应包括选择合适的寄主植物，因为不同的植物种类和生态型对有毒有机污染物的抵抗力不同。要特别注意植物根系的特点。最好的菌株应该对AM真菌侵染敏感，并通过提高根系分泌物的产量来强烈响应菌根侵染。

丛枝菌根真菌分为土著菌种和外来菌种，而土著菌种由于长期生活在已受污染的环境中，本身对污染物具有一定耐性，与植物形成共生体系后，在共生系统中能够发挥较外来种更明显和稳定的作用。因此土著丛枝菌根真菌菌剂的制备困难是现在丛枝菌根真菌尚未使用大面积污染土壤修复的重要限制因素。

利用AM真菌修复废弃矿地进行了很多的研究，但仍缺乏较大规模的系统性的实验，而且对于AM真菌修复煤矿废弃地的修复机理方面，目前还不完全清楚。采煤沉陷区土壤结构被扰动，AM真菌如何改善土壤结构，协调水肥供应，也是生态修复需要深入探讨的问题之一。废弃矿地生态修复存在实验周期长，修复过程中易损伤的问题。继续深入发掘和利用AM真菌的对于修复煤矿废弃地污染中的各种机制和机理是十分重要的，且具有重大的理论价值和现实生态意义。