脂联素对骨髓间充质干细胞的作用及其调控机制

陈野 周丰 邬琼辉 车会凌 李佳璇 申佳琪 罗恩

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医学院 成都610041

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchy‑mal stem cells，BMSCs）是由中胚层发育而来的骨髓非造血干细胞。BMSCs 具有高度可塑性，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，而其潜在的成骨分化能力是促进骨形成的基础[1‑3]。同时，BMSCs 具备强大的增殖能力、多向分化潜能、迁徙能力、低免疫原性、方便提取等优点，这也使其成为了促进骨修复重建的理想种子细胞[4]。但在目前实际应用的过程中发现BMSCs 在修复骨损伤时存在增殖、成骨分化以及迁徙能力不足等情况，这阻碍了其临床应用，因此有大量研究寻求促进BMSCs 成骨作用的新方法和条件。近年来有研究发现，脂联素（adiponectin，APN）对BMSCs 成骨作用具有正向调节作用，可能成为促进BMSCs 治疗骨疾病的重要因子[5]。本综述对APN 调控BMSCs增殖、成骨—成脂分化平衡、外周迁徙以及存活能力的具体机制的研究进展进行总结，并对其未来的研究方向进行展望，为临床治疗和预防骨折、骨缺损以及骨质疏松等颅颌面骨相关疾病提供理论依据。

1 脂联素及其受体

APN 是一种主要由脂肪组织分泌的，具有调节代谢状态和抗炎作用的蛋白质，其对代谢紊乱、心血管疾病、风湿性关节炎、癌症以及骨相关病等多种疾病具有重要调节作用[6]。APN 是由244 个氨基酸所构成的相对分子质量约为3×104的蛋白质，APN 的C'末端的球状结构域是其功能活性区[7]。在动物体内，APN 受体（adiponectin recep‑tor，AdipoR） 分 为AdipoR1/R2 两种类型。Adi‑poR1 主要在骨骼肌中表达，而AdipoR2 在肝脏组织中表达最多，有研究证实，在骨组织内也有Ad‑ipoR 的表达。AdipoR 在细胞内的结构域没有激酶活性，APN 主要通过受体相互作用蛋白APPL1 介导相关信号通路的激活，如腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate‑activated protein kinase，AMPK）通路和p38 丝裂原活化蛋白激酶（mito‑gen‑activated protein kinase，MAPK）通路等。APN作为脂肪因子不仅可以调节脂肪代谢，还能参与骨代谢，是连接脂肪组织与骨组织的重要纽带[8]。APN 对骨组织及骨相关细胞具有复杂的作用，如APN 可以激活p38MAPK 以及c‑Jun 氨基末端激酶通路促进成骨细胞增殖、分化以及矿化[9]；抑制破骨细胞的形成，促进破骨细胞凋亡等[10]。在BM‑SCs 细胞膜上有AdipoR 的表达，APN 直接与BM‑SCs 上的AdipoR 结合而激活一系列信号通路，影响BMSCs 增殖、分化、迁徙以及存活，调节BM‑SCs的骨生成过程。

2 APN调节BMSCs的增殖能力

目前，APN 对BMSCs的增殖能力的调节作用存在争议。Yu 等[11]研究发现，以1 μg·mL‑1的APN处理从野生小鼠提取的BMSCs 会促进其增殖，但是随着APN 的质量浓度增加，BMSCs增殖速度减小。而Pu 等[12]研究发现，外源性APN 对BMSCs的增殖能力影响不大。两个实验的结果都显示在处理BMSCs 24 h 之后外源性APN 对BMSCs 的增殖能力的促进作用最强，而超过48 h 后其影响逐渐减弱。与之不同的是，Wang 等[13]发现，从敲除APN 基因（APN knockout，APN‑KO）的小鼠骨髓中提取的BMSCs 比野生小鼠的BMSCs 增殖更快，其结果证实自身产生的APN会抑制BMSCs的增殖。在Kajimura 等[14]的研究中，APN‑KO 小鼠在幼龄时表现为成骨增强，而老龄时由于交感神经紧张性增强，导致成骨减少。笔者推测APN‑KO 小鼠的BMSCs 增殖加快的原因可能与FoxO1信号通路有关。总结多项实验结果得知，APN 对BMSCs 的增殖能力的调节作用会因APN 的来源、质量浓度、作用时间以及动物模型而变化。

3 APN调节BMSCs成骨—成脂分化平衡

BMSCs 具有多向分化潜能，在一定条件下可以分化为成骨细胞，适应条件下也可以分化为脂肪细胞，而在机体内BMSCs 成骨分化和成脂分化相互制约，存在平衡关系[15]。BMSCs 的成骨成脂分化平衡分化受到转录因子、信号通路、微小RNA、组蛋白修饰酶等的多重调控[16]。研究表明，APN 可以通过多种途径调节BMSCs的成骨成脂分化平衡，其主要作用是使BMSCs 趋向于成骨分化，从而使其成脂分化的比例减少。

3.1 APN可激活Wnt/β‑catenin通路

Wnt/β‑catenin 通路作为成骨的经典通路，同时也是APN促进BMSCs成骨分化的重要途径。在Wnt/β‑catenin 通路非激活状态时，细胞质内的糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK3β）使β‑catenin 磷酸化，磷酸化的β‑catenin 被泛素化降解以至于不能聚集到一定浓度而进入细胞核激活下游成骨相关转录因子。而当通路被激活时，GSK3β 会被抑制[17]，过量的β‑catenin 进入细胞核内与T 细胞因子、淋巴增强因子结合，进而激活下游目的基因，促进BMSCs向成骨分化[18]。Wang等[19]发现，当用载有APN 基因的重组腺病毒转染BMSCs 后，细胞中Wnt/β‑catenin 通路相关的分子β‑catenin、cyclinD1 表达增加；同时，成骨因子如骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）‑2、Runt 相关转录因子（runt‑related tran‑scription factor，Runx）‑2 和骨钙蛋白（osteocal‑cin，OCN）表达也增加，证实了APN 可以通过激活Wnt/β‑catenin 通路促进BMSCs 成骨分化，加速颅骨缺损的修复。进一步研究可以发现，APN 与BMSCs 上 的AdipoR1 结合，从而抑 制GSK3β 激活，使β‑catenin 在细胞质中聚集，促进BMSCs 成骨 分 化。这 证 明 了 通 过GSK3β/β‑catenin 通 路，APN可以促进BMSCs成骨分化[20]。

3.2 APN可激活APN‑APPL1‑p38 MAPK通路

p38 MAPK 是MAPK 家族中主要的激酶，并且与BMSCs 成骨分化关系密切[21]。APN 与下颌骨BMSCs （jaw bone marrow BMSCs，JBMMSCs）的AdipoR结合可以使APPL1从细胞核转移到细胞质中，并与AdipoR 结合，介导p38 MAPK 磷酸化激活[22]，p38 MAPK 激活使核转录因子c‑Jun 磷酸化，并募集c‑Jun 的共刺激因子p300，使环氧化酶‑2 （cyclooxy‑genase‑2，COX‑2） 基 因 表 达 增加，进一步使得前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）表达增加，PGE2可以使BMP‑2表达增加，通过BMP‑2/Smad/Runx‑2 通路使成骨相关转录因子Runx‑2 的表达增加，从而促进JBMMSCs 中的OCN、骨桥蛋白（osteopontin，OPG）等成骨因子的表达，进而促进JBMMSCs 分化为成骨细胞[23]。

3.3 APN 可激活磷脂酰肌醇‑3‑激酶（phosphati‑dylinositol 3‑kinase，PI3K）/蛋白激酶B（pro‑tein kinase B，Akt）途径

在PI3K/Akt 途径中，PI3K 可催化磷脂酰肌醇‑4,5‑二 磷 酸（phosphatidylinositol‑4,5‑diphos‑phate，PIP2） 生 成 磷 脂 酰 肌 醇‑3,4,5‑三 磷 酸（phosphatidylinositol‑3, 4, 5‑triphosphate， PIP3），

PIP3可以激活Akt，而激活的Akt 可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进成骨相关因子Runx‑2、OCN、碱性磷酸酶的表达，促进BMSCs 成骨分化。Liu 等[24]证实了APN 可以与BMSCs 表面的AdipoR结合，通过APPL1介导激活PI3K/Akt通路激活PI3K，以及下游的Akt，进而促进BMSCs 成骨分化。

APN 还可以抑制第10 染色体同源丢失性磷酸酶‑张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的表达从而间接激活PI3K/Akt 通路。PTEN 是一种肿瘤抑制基因，在PI3K/Akt 途径中，PTEN 编码的蛋白可以促进PIP3 生成PIP2，从而抑制BMSCs 成骨分化。APN 在激活PI3K 的同时，可抑制PTEN 基因的表达，从而促进BMSCs的成骨分化[24]。

3.4 APN可降低交感神经兴奋性

骨髓交感神经兴奋时，神经末梢会释放去甲肾上腺素，作用于BMSCs 可引起赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶［lysine（K）‑specific demethy‑lase，KDM］4B、KDM6B表达减少。KDM4B和KDM6B具有使组蛋白中甲基化的赖氨酸残基去甲基化，使组蛋白起到动态调节BMSCs 成骨因子的转录活动的作用，因此在交感神经兴奋时BMSCs 成脂分化增强，而成骨分化减弱[25]。

Wu等[25]将APN灌注于APN‑KO小鼠的侧脑室中时，发现APN可以与下丘脑的AdipoR结合，由APPL1 介导了色氨酸羟化酶2（tryptophan hydrox‑ylase 2，TPH2）激活以及五羟色胺受体2C表达增加，而TPH2可以通过促进大脑中五羟色胺的合成从而降低了交感神经的紧张性，增加BMSCs 中KDM4B 和KDM6B 的合成，使BMSCs 成骨分化增强，成脂分化减弱。这说明APN 可以通过作用于中枢神经系统，降低交感神经的兴奋性，从而促进BMSCs成骨分化。

目前大部分实验结果显示，APN 可使BMSCs的成骨分化增加，成脂分化减少，但是有学者发现，骨髓脂肪组织旁分泌的APN或者BMSCs自分泌的APN 增多时成骨分化增强，然而体内实验发现循环血中的APN 增多时机体的成骨作用受到抑制[19]。由于APN 的全身作用受到复杂的人体微环境的调控，其具体机制至今还不清楚。可能原因有以下4点：1）局部APN 过表达可能会以负反馈的形式引起循环血中APN 浓度降低，从而抑制远处组织的成骨作用；2）APN可以通过增强胰岛素的敏感性，通过AMPK 或者PPAR 配体介导脂肪动员和葡萄糖吸收增加，从而使脂肪组织减少，导致脂肪组织和胰岛β 细胞分泌的成骨相关因子，如瘦素和胰岛素减少，从而导致成骨作用减弱；3）瘦素和APN 都由脂肪组织分泌，相互具有拮抗关系，APN 分泌增多，会导致瘦素分泌减少，瘦素减少会导致BMSCs 成骨分化减少[26]；4）APN 会抑制成脂分化，导致脂肪细胞分泌的雌激素减少，从而抑制BMSCs成骨分化。

4 APN促进BMSCs向外周迁徙

BMSCs 是细胞疗法和组织修复中最常用的干细胞，其强大的迁徙能力起到了重要作用。BMSCs 迁徙需要经过离巢、进入外周血循环和进入受损区域这3个阶段[27]。在此过程中，复杂的化学分子机制和物理作用扮演着重要角色。APN 可以促进BMSCs 离巢并进入外周血，同时促进BMSCs 募集到骨缺损处或者骨折处，从而有利于BMSCs参与骨缺损或者骨折的修复。

基质细胞衍生因子‑1（stromal cell‑derived fac‑tor‑1，SDF‑1）/趋化因子受体4［cysteine(C)‑X‑C motif chemokine receptor，CXCR4］轴是目前研究较多的趋化BMSCs 迁徙的通路，APN 对SDF‑1/CXCR4 轴有调控作用。在糖尿病以及肥胖患者中，骨髓交感神经功能紊乱，使骨髓微环境中SDF‑1浓度升高，血窦中SDF‑1浓度降低，不利于表达CXCR4 的BMSCs 的趋化。Yu 等[28]发现，给食物源性肥胖小鼠皮下注射APN，骨髓中交感神经兴奋性降低，导致骨髓组织中SDF‑1 的水平下调，从而趋化BMSCs 进入外周循环。循环系统中的APN，可以与BMSCs 的AdipoR1 结合，使AipoR1‑CK2‑Smad1/5/8 复合体解离，从而使释放的Smad1/5/8 被磷酸化，进入细胞核，上调SDF‑1的转录，使骨缺损处形成高浓度水平的SDF‑1，有利于BMSCs 向骨缺损处迁徙。Wu 等[29]进一步发现，APN 受体激动剂AdipoRon可以降低骨髓中SDF‑1的浓度，有利于2型糖尿病相关的牙周炎所引起的牙槽骨吸收的恢复。

除了SDF‑1/CXCR4 轴之外，Pu 等[12]发现APN可作用于JBMMSCs 的AdipoR，通过APPL1 介导AMPK 和p38 MAPK 的磷酸化激活，促进CXCL1和CXCL8 的表达，分别与CXCR1 和CXCR1/2 结合，从而使JBMMSCs 向外周表达CXCR1/2 的骨缺损处迁徙。APN 在促进JBMMSCs 向外周迁徙的同时，又可以通过APPL1‑p38 MAPK 通路促进JBMMSCs 成骨分化，这两个过程既同步又独立，共同促进外周骨缺损处的愈合。

综合实验结果能够得知，APN 对BMSCs从骨髓向外周迁徙具有确切的促进作用，而这主要是通过CXCL/CXCR轴来实现的。

5 APN有利于移植BMSCs存活

虽然BMSCs 可以迁徙到骨缺损处促进骨修复，但是BMSCs 从骨髓迁徙到骨损伤处的效率并不高[30]。目前研究者主要是通过组织工程技术将BMSCs 吸附到具有生物相容性的材料上植入骨缺损处来促进骨生成，但是仍存在植入体内的BMSCs 在缺血缺氧等环境内不易于存活、细胞凋亡等问题，因此除了种子细胞和生物材料之外常常还需要添加生长因子。研究[31‑32]发现，APN可以通过AdipoR1 介导AMPK 通路激活，进而激活乙酰辅酶A，使凋亡相关基因Bax 表达减少，Bcl‑2表达增多从而抑制BMSCs 凋亡。而生长因子如转移生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子表达增多，利于BMSCs在缺氧缺血条件下生存。Malih等[33]研究发现，AdipoRon 可以作用于BMSCs，进而激活COX‑2/PGE2/低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor‑1，HIF‑1）通路，HIF‑1 可以促进CXCR4、CC 趋化因子受体2、VEGF、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） ‑2、MMP‑9 基因的表达。这证实了AdipoRon 可以激活COX‑2/PGE2/ HIF‑1 通路促进BMSCs 迁徙以及周围血管生成从而提高其存活率。

综合以上结果可知，APN 可通过抑制BMSCs凋亡，促进BMSCs 移动，以及分泌VEGF 等促血管生成因子，来有效增强植入BMSCs 的存活能力，有利于骨缺损的修复。

6 总结与展望

APN 对BMSCs增殖、分化、迁徙功能以及存活能力具有复杂的调节作用。APN 可以通过一系列化学信号通路以及降低交感神经紧张性促进BMSCs 成骨分化，通过CXCL/CXCR 轴促进BMSCs 向外周循环中迁徙，抑制细胞凋亡，促进其在缺氧缺血微环境中存活。

骨质疏松与BMSCs 成骨作用失调密切相关。研究发现，老年人以及糖尿病患者因为骨髓内氧化应激水平高，以及成脂因子表达增加，导致BMSCs 成骨分化减少，成脂分化增加，进而骨量—脂肪含量失衡，最终引起骨质疏松，而发生在颌骨则严重影响咀嚼功能以及种植体固位。APN可以下调骨髓氧化应激水平，调节BMSCs 成骨—成脂分化平衡并促进BMSCs 迁徙到远处成骨。在口腔医学领域，研究APN 在预防及治疗骨质疏松相关颌骨骨折的作用以及促进种植体周围骨整合的具体机制是未来研究的重要方向[34‑38]。同时，APN 对BMSCs的这种复杂的调控作用，在颌面部外伤和良恶性肿瘤引起的颌骨缺损的修复重建中具有广阔的前景。

APN 在颅颌面骨疾病领域有很大的临床应用前景，但同时也面临许多问题。1）临床研究发现，体循环中APN 浓度与骨密度呈负相关，与骨折风险正相关。所以如何制定合理可行的治疗方案，包括制定APN 的注射方式、剂量、次数等。2）研究发现，APN可能会成为治疗骨质疏松的靶点，但是降低APN 浓度会增加冠心病、肥胖、高血压、动脉粥样硬化等疾病的风险。3）APN在不同疾病状态、不同部位的成骨作用有异质性。因此，如何减少APN 应用的不良反应，增加APN 对BMSCs 调控效率及其具体机制等仍是以后研究需攻克的难点，探索改善机体干细胞修复潜能的手段，对颅颌面骨疾病的治疗具有重要意义。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。