原子荧光光谱法测定灵芝孢子粉有机硒含量

张 剑，弓志青，王文亮，罗金华，邓利玲

（1. 山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东济南 250100；2. 重庆市生物技术研究所有限责任公司，重庆 400222）

硒是人体必需的微量元素之一，具有提高人体免疫力、预防多种疾病等生理功能[1]。摄入不足会引起克山病、大骨节病等，过量摄入会引起关节痛、腹泻、脱发等症状[2]。根据硒的存在形式可以分为无机硒和有机硒，无机硒主要以硒酸盐和亚硒酸盐形式存在，有机硒主要为硒蛋白、硒代氨基酸、硒多糖等形式。与无机硒相比，有机硒具有更易被机体吸收利用、安全性更高的特点[3]。因此，如何有效地将无机硒转化成有机硒是目前的研究方向之一。

灵芝是传统的食药用菌，含有丰富的营养及功能成分，具有抗肿瘤、调节免疫、抗衰老、降三高等多种功效[4]。作为硒转化生物载体，灵芝具有耐硒能力强、转化水平高等优点[5-6]，其生长周期短、栽培条件可控，因此富硒灵芝具有广阔的发展前景。

目前，硒的检测方法主要有石墨炉原子吸收光谱法[7-8]、X 射线荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法、高效液相色谱－原子荧光光谱法等[9]。由于不同物质中硒的形态各异，不同方法均有其优势。同时，硒的安全与毒性剂量的范围较窄，合理选择检测方法才能更加准确地测定硒的含量，确保富硒产品的营养安全性。

试验采用氢化物发生- 原子荧光光谱法测定灵芝孢子粉中的总硒、无机硒，通过差减法计算总有机硒的含量，旨在为富硒灵芝孢子粉硒含量测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与样品

硒标准溶液100 mg/L，国家环境保护总局标准样品研究所提供；硝酸、高氯酸、盐酸氢氧化钠、硼氢化钠，均为分析纯；试验用水为超纯水；灵芝孢子粉样品，重庆市生物技术研究所有限责任公司提供。

1.2 仪器与设备

FA-1004 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；微波消解仪ETHOS 1、MILESTONE PF32原子荧光光度仪（配硒空心阴极灯），北京普析通用仪器有限责任公司产品；超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 总硒的测定

参照GB 5009.93—2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》，采用氢化物原子荧光光谱法，对检测条件进行优化后测定总硒含量。

PF32 原子荧光光度仪优化参数见表1。

表1 PF32 原子荧光光度仪优化参数

1.3.2 样品消解方法

采用微波消解方法，称取灵芝孢子粉0.5 g（精确至0.001 g），置于消化管中，加10 mL 硝酸、2 mL 过氧化氢，振摇混合均匀，于微波消解仪中消化。

微波消解程序见表2。

表2 微波消解程序

消解完成待冷却后，将消化液转入锥形烧瓶中，在电热板上（150～180 ℃） 加热至近干，再加6 mol/L盐酸溶液5 mL，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，冷却，转移至10 mL 容量瓶中，加入铁氰化钾溶液，用水定容，混匀待测，同时做空白试验。

1.3.3 无机硒的测定

参照DB 3301/T117—2007《稻米中有机硒和无机硒含量的测定- 原子荧光光谱法》，采用盐酸水浴的方法对灵芝孢子粉中的无机硒进行提取，使其与有机硒分离，再用1.3.1 中的方法检测无机硒含量。

1.3.4 标准曲线绘制

准确移取一定量的硒标准溶液，用盐酸及超纯水配置成最高质量浓度的硒溶液10.00 μg/L，由原子荧光光度仪自动稀释成8.00，6.00，4.00，2.00 μg/L，以测得的荧光强度（IF） 为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，通过仪器工作站求出回归方程、相关系数。

1.3.5 有机硒含量的计算

根据测得的总硒和无机硒含量，利用差减法计算得出，即有机硒含量=总硒含量- 无机硒含量。

1.3.6 精密度及回收率

称取1～8 号灵芝孢子粉0.5 g（精确至0.001 g），分别加入含量为0.400，0.200 mg/kg 的硒标准溶液，分别按1.3.1 和1.3.3 中的方法检测总硒和无机硒含量，计算该方法的总硒、无机硒的加样回收率及相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及检出限

标准曲线见图1。

图1 标准曲线

由图1 可知，标准曲线为Y=64.213X+0.23，其中R2=0.999 5，线性范围0～10.00 μg/L。按照仪器设定的检出限程序，连续测定样品空白15 次，得到空白荧光值的标准偏差，根据标准偏差法计算得出检出限为0.008 μg/L。

2.2 富硒灵芝孢子粉有机硒含量测定

对不同的富硒灵芝孢子粉中的总硒、无机硒进行测量，并计算出有机硒含量。

灵芝孢子粉中不同硒形态含量及所占比例见表3。

表3 灵芝孢子粉中不同硒形态含量及所占比例

2.3 精密度与加标回收率

各样品总硒和无机硒回收率见表4。

表4 各样品总硒和无机硒回收率

由表4 可知，对不同的样品分别加入不同含量的硒标准溶液，分别测定总硒及无机硒含量，得出总硒的回收率为97.50%～103.75%，RSD 为2.44%，无机硒的回收率为97.00%～102.00%，RSD 为1.98%。

3 结论

采用氢化物原子荧光光谱法结合盐酸浸提的方法测定灵芝孢子粉中总硒和无机硒的含量，并用差减法计算出有机硒的含量。结果表明，灵芝孢子粉中的硒主要是以有机硒形式存在，占比80.00%～93.44%，再次验证了灵芝是很好的硒转化生物载体。经过方法学验证，该方法相对准确、稳定，适合灵芝孢子粉中有机硒含量测定，同时也为其相关产品有机硒含量的测定提供参考。