nesfatin-1在胰岛素抵抗骨骼肌细胞中对PI3K/AKT信号通路的影响

王茜 李明泽 张晗 张琳 章莹 程峣 袁燕 李思成 赵宇 廖鑫 高琳

(遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563003)

研究发现2型糖尿病的症状是由于骨骼肌和脂肪细胞在最早阶段胰岛素信号传导减弱使葡萄糖摄取减少导致摄取葡萄糖的能力受损所引起的〔1,2〕，而磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路是胰岛素在葡萄糖代谢过程中最主要信号通路。新型饱食分子蛋白(nesfatin-1)作为一种新型的代谢调控因子，参与调节胰岛素分泌，是一种葡萄糖反应性的胰岛素抵抗肽，可以通过外周的潜在作用调控葡萄糖稳态和全身能量平衡在糖脂代谢和糖尿病及其并发症的发展中起关键调节作用〔3,4〕。nesfatin-1同胰岛素可能存在协同作用，并具有类胰岛素样作用〔5〕。nesfatin-1的表达、分泌和(或)作用的功能障碍在与胰岛素抵抗及胰岛素信号通路相关的发病机制中发挥着重要作用，但其是否是通过 PI3K/AKT 信号通路调节外周组织骨骼肌糖代谢及胰岛素抵抗的研究未见报道。本研究通过前期构建的骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型，体外给予腺病毒空载体、nesfatin-1过表达腺病毒载体，分析nesfatin-1表达变化对骨骼肌胰岛素抵抗及对PI3K/AKT信号通路中下游指标糖原合成酶激酶(GSK)-3β、 葡萄糖转运蛋白(GLUT)-4的影响，初步探讨nesfatin-1在胰岛素抵抗骨骼肌PI3K/AKT信号通路中可能的分子机制，旨在为防治糖尿病及胰岛素抵抗相关的代谢性疾病提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 棕榈酸(PA)溶于0.1 mol/L氢氧化钠(NaOH)中，加入小牛血清白蛋白(BSA)，配制成10%BSA，5 mmol/L PA终浓度的母液，-20℃保存，以备后用。L6大鼠成肌细胞购自中国科学院细胞库；胎牛血清、DMEM培养基、含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶、青链霉素双抗购自Gibco公司；PA购自Aladdin试剂(上海)有限公司；重组人胰岛素(Insulin)购自Solarbio公司；含nesfatin-1基因的重组腺相关病毒载体及空载对照(PC)腺相关病毒载体由南京申基生物科技有限公司设计构建；葡萄糖检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；PI3K的催化亚基p110、磷酸化(p)-AKT(S473)、GSK-3β、GLUT4及内参甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自中国Proteintech公司。

1.2细胞分化及诱导 将复苏后的 L6 细胞放入DMEM 培养基中，在适当条件下进行培养，细胞密度达到80%后更换为2%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，待细胞逐渐行程规律性向同一边生长的状态，梭形为主，呈现肌形结构，诱导分化6～8 d，每2 d更换培养基，当细胞融合至80%～90%时，加入含 EDTA 的胰蛋白酶进行消化传代。

1.3建立胰岛素抵抗模型 本研究团队前期将诱导分化后的细胞分为4组，正常对照组(control组)内加入不含胰岛素的PA的缓冲液；PA 组加入250 μmol/L PA；Insulin 组加入100 nmol/L Insulin、 PA+Insulin 组加入250 μmol/L PA+100 nmol/L Insulin，待处理0 h、6 h、12 h、24 h后收集培养基上清，采用葡萄糖过氧化物酶方法测定上清液中葡萄糖含量，由于细胞上清液中葡萄糖含量越高代表胰岛素抵抗越明显，Insulin组与PA+Insulin组上清液葡萄糖含量在24 h时差值最大，提示胰岛素抵抗效果逐渐明显，故后续实验处理时间选为24 h〔6〕。以此建立胰岛素抵抗模型。

1.4细胞上清液葡萄糖含量检测 将细胞通过离心、取沉淀、清洗、再离心、其沉淀、匀浆、孵育等过程，用分光光度计测定505 nm波长处吸光度，每组3个样本，实验重复3次，以此用葡萄糖过氧化物酶方法测定上清液中葡萄糖含量。

1.5L6细胞相关腺病毒感染及分组 取L6骨骼肌细胞均匀种植于12孔板，将过表达nesfatin-1和PC腺相关病毒原液1 μl加入细胞中，感染病毒约48 h后，将感染成功细胞分为空载对照腺相关病毒组(PC 组) 、PC+PA 组 、过表达nesfatin-1(OE)组和nesfatin-1+PA 组，各组均加入100 nmol/L Insulin，PC+PA 组和nesfatin-1+PA 组再加入250 μmol/L PA 处理24 h后收集培养基上清，采用葡萄糖过氧化物酶方法测定上清液中葡萄糖含量，用Western印迹检测PI3K/AKT通路及其下游信号分子GSK-3β、GLUT-4的表达。

1.6Western印迹检测细胞中相关分子的表达 将采用相关腺病毒感染处理后的L6 细胞加入RIPA 裂解液裂解细胞，提取细胞全蛋白，检测蛋白浓度。各组蛋白样品经10% 聚丙烯凝胶电泳后转膜封闭，一抗(1∶2 000)4℃过夜，二抗(1∶2 000)室温孵育1 h后，经过TBST 洗4次，最后用电化学发光(ECL)系统进行曝光检件检测蛋白条带的灰度值，以目的条带和内参GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1nesfatin-1过表达腺病毒的验证 OE组中nesfatin-1蛋白表达水平明显高于PC组(2.67±0.31 vs 1.00±0.00，P<0.01)，nesfatin-1过表达腺病毒构建成功。见图1。

2.2过表达nesfatin-1对葡萄糖的影响 PC+PA组上清液中葡萄糖含量〔(140.05±2.37)mmol/L〕明显高于PC组〔(122.40±2.93)mmol/L,P<0.05〕；OE组上清液中葡萄糖含量〔(100.00±3.02)mmol/L〕明显低于PC 组(P<0.05)；nesfatin-1+PA组上清液中葡萄糖含量〔(132.26±2.37)mmol/L〕明显低于PC+PA组(P<0.05)，nesfatin-1+PA组上清液中葡萄糖含量明显高于OE组(P<0.05)。

图1 Western印迹法检测nesfatin-1蛋白表达水平

2.3过表达nesfatin对PI3K、p-AKT、GSK-3β、GLUT-4的影响 各组PI3K蛋白表达水平均无明显区别(P>0.05)； 与PC组比较，PC+PA组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显下降(P<0.05)；与PC组比较，OE组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显增高(P<0.05)；与PC+PA组相比，nesfatin-1+PA组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显增高(P<0.05)；与OE组相比，nesfatin-1+PA组p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。见图2、表3。

图2 过表达nesfatin对PI3K、pAKT、GSK-3β、GLUT-4的影响

表3 过表达nesfatin-1对PI3K、p-AKT、GSK3β、GLUT-4的影响

3 讨 论

骨骼肌是机体摄取葡萄糖最主要的组织，研究表明，葡萄糖在骨骼肌中转运受损包括葡萄糖的传递、运输和磷酸化，这些过程所导致的细胞损伤过程是引起外周胰岛素抵抗的重要原因〔7〕，因此，骨骼肌是肥胖和胰岛素抵抗的重要部位〔8〕。葡萄糖转运到骨骼肌和脂肪细胞中的调节对于维持葡萄糖代谢和体内平衡是至关重要的〔9〕，所以推测改善骨骼肌胰岛素的敏感性可能是治疗2型糖尿病的有效方法。

nesfatin-1是由下丘脑室旁核、视上核、弓状核、下丘脑外侧区和脊髓神经元及外周组织(胰腺、肝脏、皮下和内脏脂肪组织、褐色脂肪组织)和骨骼肌分泌，被认为能影响体内许多功能。nesfatin-1通过抑制食物摄入，对能量代谢产生调节作用，此外，它可作为一个神经内分泌调节剂，调节心脏功能，降低血糖水平，并导致体重减轻，同时减少能量摄入〔10〕。2型糖尿病患者胰腺细胞中的nesfatin-1 mRNA的表达减少，妊娠糖尿病患者nesfatin-1也降低，在肥胖和糖尿病患者的中nesfatin-1的水平也明显下降〔11～13〕，可以推测nesfatin-1与肥胖和胰岛素抵抗可能存在一定的关系。Su等〔4〕通过外源注射nesfatin-1治疗高血糖小鼠，结果显示高血糖小鼠的血糖出现下降，证明nesfatin-1有降低血糖水平的作用。此外，Dore等〔14〕提出Nesfatin-1的降血糖作用是通过增加细胞对葡萄糖的摄取和通过提高胰岛素敏感性抑制肝脏的葡萄糖异生作用介导的〔14〕，推测nesfatin-1是通过提高胰岛素敏感性来改善2型糖尿病。证实nesfatin-1可增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，减轻胰岛素抵抗。

胰岛素抵抗在2型糖尿病的发病和进展中起着至关重要的作用，这种作用通常是由于胰岛素信号通路减弱所引起〔15,16〕，而PI3K/AKT信号通路是胰岛素作用的最主要信号通路。针对nesfatin-1对PI3K/AKT信号通路的作用，Khalili等〔15〕证实，nesfatin-1可通过直接作用Ⅰ型钙离子通道从而促进葡萄糖刺激的细胞分泌胰岛素。在相关的动物实验中发现，nesfatin-1可引起AKT磷酸化水平的增加，从而参与促进肌肉细胞葡萄糖摄取和葡萄糖转运〔16〕。在喂食正常饲料的小鼠中，nesfatin-1可改善葡萄糖耐量，提高了AKT mRNA水平及骨骼肌中的磷酸化水平，在喂食高脂肪饮食小鼠中，nesfatin-1不仅能产生在喂食正常饲料小鼠中相同的作用，而且还抑制了食欲，提高了肝组织中的AKT水平〔17〕。中枢nesfatin-1可能通过激活胰岛素受体(InsR)→InSr底物(IRS-1)→Akt信号通路级联，促进肌肉葡萄糖摄取，从而增加胰岛素敏感性〔18〕。中枢nesfatin-1表达下调能够明显抑制普食喂养或高脂喂养的大鼠肝脏AKT 磷酸化水平，推测中枢nesfatin-1的抑制可能是通过抑制InsR/IRS-1/AKT 胰岛素信号作用通路从而促进机体胰岛素抵抗的发生发展〔19〕。本实验结果证实了上调nesfatin-1不仅能改善骨骼肌胰岛素抵抗，而且这种作用可能是通过上调AKT磷酸化水平而完成。

GLUT-4是AKT的重要底物，是一种胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白，主要存在于脂肪、骨骼或心脏组织中〔20〕。在骨骼肌中，发展胰岛素抵抗和2型糖尿病的早期步骤是GLUT-4表达和易位的减少〔21〕，而PI3K/AKT信号通路在胰岛素刺激的GLUT-4易位中起关键作用，并且该级联的损伤导致胰岛素诱导的葡萄糖转运至肌细胞的数量减少，进而导致胰岛素抵抗和2型糖尿病〔22〕。GLUT-4的表达失调或功能受损可引起胰岛素抵抗，所以GLUT-4被认为是2型糖尿病的潜在治疗靶点。本实验结果表明，在存在胰岛素抵抗的骨骼肌细胞中，通过过表达nesfatin-1，发现不仅AKT磷酸化水平增高，而且AKT底物GLUT-4亦出现增高，推测nesfatin-1对胰岛素抵抗及血糖的调节可能是通过上调AKT的磷酸化及GLUT-4的表达来实现的。有学者认为nesfatin-1对葡萄糖代谢的影响与AKT和GLUT-4有关〔19〕，本实验结果与之相一致。在PI3K/AKT信号通路下游的GSK-3β是调节糖原合成的重要底物，本实验结果亦证实，过表达nesfatin-1均可上调p-AKT及下游的GSK-3β的表达，由此可以推测，GSK-3β可能是nesfatin-1改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗作用的一个靶点。

但是本实验对PI3K蛋白的检测各组间均无明显差异，考虑nesfatin-1可能对PI3K/AKT通路的影响是直接激活Akt及下游底物GLUT4和GSK-3β，对上游的PI3K无作用。而且本实验只采用了nesfatin-1过表达腺病毒载体，未使用nesfatin-1表达抑制腺病毒载体，存在部分缺陷，所以本研究团队接下来将进一步通过转染nesfatin-1表达抑制腺病毒载体，并使用该通路的激动剂及抑制剂，更全面的研究其与该通路的关系。

综上所述，过表达nesfatin-1可显著增加细胞对葡萄糖的摄取，减轻胰岛素抵抗，同时能够刺激Akt磷酸化，上调下游糖代谢相关的GSK-3β、GLUT-4的表达。