欧李多酚提取纯化及抗氧化性研究

刘皓涵，钟迪颖，张润光，王国良，张有林

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119）

0 引 言

欧李（Cerasus humilis(Bge.) Sok）又名“钙果”，属于蔷薇科（Rosaceae）樱桃属（Ceraras），是中国特有的果药兼用型树种[1]，生长于荒山或沙漠区，耐干旱，耐风寒，耐盐碱，是一种适应性很强的野生果树，欧李植株高约0.3～0.7 m，叶片长5.4 cm为绿色、叶片宽约3.2 cm，花期在 4月份左右，果实成熟期因地域和品种的原因大约在7月份左右。果实呈黄色或鲜红色，直径约2.5 cm，单果重约15 g，按硬度分为硬肉果实和软肉果实2种[2-4]。欧李果营养丰富，钙含量极高，有“绿色天然钙源”的美誉，引起了人们的高度重视，近年来开始人工栽培，主要种植区为长江以北的省、市、自治区，资源相当丰富[5-8]。欧李果有机酸和酚类物质含量高，糖含量较低，多数品种口感酸涩[9-10]。多酚是重要的天然抗氧化物质，具有软化血管、促进消化、降血脂、利尿、增加免疫力，防止动脉硬化和血栓的形成，具有抑制细菌与癌细胞生长的作用[11-14]，特别在抑制人体肝癌（HepG2）、结肠癌（HCT116）及胃癌（BGC823）细胞增殖方面的作用显著[15]。目前关于欧李果中所含天然活性物质及其作用机理报道甚少，本试验研究了欧李多酚类物质的提取和纯化工艺，测定多酚类物质的种类和含量，探索多酚类物质的体外抗氧化活性，旨在为开发欧李果提供理论依据和技术支持[16]。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

欧李（京欧2号）果实于2018年10月7日采于陕西省沙漠研究所，植株4 a生，果实9成熟，大小、 色泽一致，采摘当天运往果品冷库储藏备用。

试剂：果胶酶（20 000 U/g）由上海蓝季科技发展有限公司生产，没食子酸标准品由天津一方科技有限公司生产，Folin-Ciocalteus试剂、无水乙醇、石油醚、氯仿、氢氧化钠、碳酸钠、乙酸乙酯、HCl、抗坏血酸、过硫酸钾、水杨酸钠、焦性没食子酸、硫酸亚铁等其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

数显鼓风干燥箱，GZX-9146MBE型，上海医疗设备厂生产；高效液相色谱仪，Thermo型，美国热电公司生产；超声波清洗仪，KQ320OB型，购于昆山市超声仪器有限公司。高速万能粉碎机，DFY-30型，温岭市林大机械有限公司生产；全波长酶标仪，9 Multiskan Go型，美国热电公司生产；高速冷冻离心机，TGL-16GR型，上海安亭有限公司生产；35mm×300 mm具四氟活塞层析柱，上海荣盛生物技术有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 欧李粉的制备

选取无虫害、无腐烂的欧李果实，破果、去核、预冻后置于冷冻干燥机中冻干，用粉碎机以1 000 r/min粉碎，索氏提取法脱脂。脱脂方法：石油醚为溶剂，以料液比1∶40（g/mL）在50 ℃温度下回流浸提 6 h。自然挥发石油醚后，将其置于鼓风干燥箱中在60 ℃温度下干燥1 h，得欧李脱脂粉。

1.3.2 欧李多酚类物质提取方法

参考徐彩红等[17]的方法，采用超声辅助酶解法，稍作修改。在预试验的基础上，称取3份欧李脱脂粉各1 g，分别放置在 3个相同的容量瓶中，果胶酶的添加量以果胶酶：欧李脱脂粉 1∶7（mg/g）分别加入，在容量瓶中分别加入60%乙醇溶液，使最终的液料比达到40∶1（mL/g），使用0.2 mol/L HCl溶液调节pH值为6.0，在50 ℃水浴中酶解预处理 2 h，浸提结束后沸水浴灭酶，放置离心机中（6 000 r/min）离心10 min，取上清液，用60%乙醇定容至50 mL，用福林-酚比色法测定多酚含量。

1.3.3 提取液的选择

参考高林晓等[18]的方法，稍作修改。准确称取欧李脱脂粉1 g，分别用95%甲醇、95%乙醇、95%乙酸乙酯和 95%的乙醚以液料比 40∶1（mL/g）提取欧李多酚，将提取液放置离心机中（6 000 r/min）旋转10 min，取上清液，定容至50 mL容量瓶备用。利用酶标仪在765 nm下测定上述提取液吸光度值，用没食子酸绘制标准曲线方程y=0.010 4x+0.003 4，决定系数为R2=0.999 5，线性相关性良好。将测得的吸光度值代入上述标准曲线方程可算得最佳提取液。

1.3.4 总酚质量分数的测定

参考徐洪宇等[19]的方法，采用福林-酚比色法，稍作修改。利用1.3.3节没食子酸标准曲线方程计算欧李果中多酚的提取量m。

式中A为样品液吸光度值；0.003 4为空白吸光度值；v为样品液体积，mL；d为样品液稀释倍数；0.010 4为没食子酸标准曲线斜率。

式中M为样品质量，g。

1.3.5 单因素试验

分别选取酶解时间 40、70、90、120、150 min，液料比以（体积质量比）20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g，超声波功率60、75、90、105、120 W，酶解温度30、40、50、60、70 ℃，依次比较不同因素下各水平对欧李总多酚得率的影响，以期获得超声辅助酶解提取欧李总多酚的最优水平。

1.3.6 响应面试验

在单因素试验的基础上，选取对欧李多酚提取有显著影响的酶解时间、酶解温度、超声波功率和液料比 4个因素为自变量，以欧李多酚提取量为响应值，进行中心组合试验设计，试验因素、水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 欧李多酚纯化试验

参考何婷等[20]的方法，采用大孔树脂纯化法，稍作修改。将欧李多酚粗提液旋转蒸发回收乙醇得浓缩液，将LSA-5B型大孔树脂用 95%乙醇活化好装柱，采用湿法上样。配制上样液浓度为2.0 mg/mL，设定流速3 BV/h，上样量为4 BV。吸附完成后用蒸馏水清洗树脂，以60%的乙醇按3 BV/h的流速解吸附，收集第 3 BV洗脱液，旋转蒸发回收，通过真空冷冻干燥即可得到欧李多酚纯化物[21]。

1.3.8 欧李多酚成分测定

采用高效液相色谱法，参考冯媛媛[22]的方法，稍作修改。标准品的制备：精确称取绿原酸、没食子儿茶素没食子酸酯、咖啡因、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、没食子酸的标准品各0.1 mg放置各自容量瓶中，用色谱级甲醇溶解分别定容至10 mL，得到1.0 mg/mL单标溶液，同时制备外标溶液。色谱条件：色谱柱为 Diamonsil 5μm C18(2)，4.6×250 nm，紫外检测波长280 nm，柱温30°C，进样量10μL，流速l mL/min，用外标法测定含量。流动相A：甲醇∶乙腈∶甲酸为500∶499∶1；流动相B：水∶甲醇∶甲酸为949∶50∶1。

1.4 抗氧化活性指标

1.4.1 总还原力测定

参考Li等[23]，采用铁氰化钾还原法，稍作修改。取3 mL样品液、3 mL铁氰化钾（1%）、3 mL pH值为6.6的磷酸盐缓冲液混匀后，置于 55 ℃的水浴锅中水浴30 min，冷却后迅速加入3 mL三氯乙酸（10%），用离心机以5 000 r/min离心15 min，取上清液5、4 mL蒸馏水和2 mL FeCl3（0.2%）混匀，在波长700 nm处测定吸光度值。以蒸馏水为空白样，测定3次取平均值。

1.4.2 DPPH·自由基清除力测定

参考Song 等[24]的方法，稍作修改。在10 mL容量瓶中依次加入制备好的DPPH·溶液4.0 mL和欧李多酚提取液4.0 mL，再加入无水乙醇定容至刻度，摇匀后立即用酶标仪在波长510 nm处测定吸光度值A0，同时将样液在室温下避光处理30 min，测定吸光度值A1，对照组加入DPPH·的乙醇溶液，其吸光值为A2，每个试样平行测定3次，取其均值。DPPH·清除率用k(%)表示。

式中A0为乙醇吸光值；A1为含样品吸光值；A2为对照组吸光值。

1.4.3 ABTS·自由基清除力测定

参考藤左[25]的方法，稍作修改。在10 mL容量瓶中依次加入7mmol/L的ABTS·溶液0.3 mL和3 mmol/L的K2S2O8溶液 0.3 mL混合均匀，在室温条件下避光反应12 h，用95%乙醇稀释50倍备用。分别取上述溶液0.8 mL 2份，分别加入0.2 mL 95%乙醇和0.2 mL欧李多酚提取液，充分摇匀10 s，静置6 min，在波长734 nm处测定吸光度值A0和A'1，每个试样测定 3次，取其均值。ABTS·清除率用k(%)表示。

式中A0为乙醇吸光值；A’1为欧李样品吸光值。

1.4.4 羟基自由基清除力测定

参考李松林等[26]的方法，稍作修改。将5.0 mL欧李样品液、3.0 mL FeSO4（0.3 mmol/mL）、2.0 mL水杨酸-乙醇（0.3 mmol/mL）和0.1 mLH2O2（0.03%）混合反应。空白不添加H2O2溶液，在波长510 nm处测定吸光值，重复3次取均值A1。计算公式如下：

式中A3为蒸馏水吸光值。

1.5 数据处理与统计分析

做3次平行测定，结果以平均值±标准差（±SD）表示。试验数据采用 Excel 2010作图、Origin2018 分析软件统计分析。显著水平P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 欧李多酚提取单因素试验

2.1.1 酶解时间对欧李多酚提取量的影响

以样品中欧李多酚含量作为判定指标，在预试验的基础上，固定酶解温度50℃、超声波功率105 W、液料比30∶1（mL/g），确定酶解时间对欧李多酚提取量的影响，结果见图1。由图1 看出，初期随着酶解时间的增加，欧李多酚的提取量显著提高，这是果胶酶破坏了欧李果肉果皮的细胞壁与细胞间质，使细胞内的物质快速溶出[27]。酶解时间达到 70 min时，提取量最高达（39±0.01）mg/g，且与酶解 40 min组差异显著（P＜0.05）。这可能是当酶解时间达到70 min时，欧李果中的多酚几乎全部溶出，如果再增加酶解时间，对欧李果多酚提取量影响不大，最适酶解时间以70 min为宜。

图1 酶解时间对欧李多酚提取量的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of polyphenols from fructus auriculata

2.1.2 超声波功率对欧李多酚提取量的影响

以样品中欧李多酚提取量作为判定指标，在预试验的基础上，固定酶解温度50 ℃、酶解时间70 min、液料比30∶1（mL/g），确定超声波功率对欧李果多酚提取量的影响，结果见图2。由图2看出，初期随着超声波功率的增大，欧李多酚的提取量逐渐提高，这是大功率超声波对欧李果细胞破坏程度大，有利于欧李多酚类物质的浸出[28]。超声波功率达到 105 W 时，提取量最高达(40.83±0.02) mg/g，且与其他各组差异显著（P＜0.05）。当超声波功率超过105 W时欧李多酚提取量呈下降趋势，这可能是超声波功率过高会破坏欧李多酚类物质中的邻二酚羟基等物质的结构，从而导致提取量下降[29]。因此提取欧李多酚的最佳超声波功率为105 W。

图2 超声波功率对欧李多酚提取量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from fructus auriculatus

2.1.3 酶解温度对欧李多酚提取量的影响

以样品中欧李多酚含量作为判定指标，在预试验的基础上，固定酶解时间70 min、超声波功率105 W、液料比30∶1（mL/g），确定酶解温度对欧李多酚提取量的影响，结果见图3。由图3看出，初期随着酶解温度的增加，欧李多酚的提取量显著提高，这是适宜的温度加速了酶促反应。当酶解温度达到 50 ℃时，提取量最高达(40.03±0.12) mg/g，且与其他各组差异显著（P＜0.05）。当酶解温度高于50 ℃，欧李多酚提取量呈下降趋势，这是因为高温会导致果胶酶失活。因此本试验提取欧李多酚酶解温度以50 ℃为宜。

图3 酶解温度对欧李多酚提取量的影响Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of polyphenols from fructus auriculata

2.1.4 料液比对欧李多酚提取量的影响

以样品中欧李多酚含量作为判定指标，在预试验的基础上，固定酶解温度50 ℃、酶解时间70 min、超声波功率105 W，确定液料比对欧李果多酚提取量的影响，结果见图4。由图4看出，初期随着液料比的增加，多酚的提取量显著提高，这是因为溶剂分子能溶解更多的溶质分子，从而有利于多酚类物质的浸出[30]。当液料比30∶1（mL /g）时，提取量最高达（39.962 ±0.05）mg/g，且与其他各组差异显著（P＜0.05）。当液料比超过30∶1（mL /g）时，多酚提取量增加不显著。提取欧李多酚最适液料比以30∶1（mL /g）为宜。

图4 液料比对欧李多酚提取量的影响Fig.4 Effects of liquid-material ratio on the extraction amount of cerasus humilis polyphenol

2.2 欧李多酚提取响应面试验与结果分析

2.2.1 响应面试验设计及回归分析

在单因素试验的基础上，选用酶解温度、酶解时间、超声波功率、液料比4个因素为响应变量，依据Box-behnken Design原理，设计4因素3水平响应面试验，结果见表2。

由表1试验结果看出，利用软件 Design Expert8.0.6得出各因素与欧李多酚提取量之间的回归方程为

由方程看出，二次项的系数都是负数，表明抛物面开口向下，具有极大值点。

将以上回归模型进行方差分析，结果见表3。模型回归极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），说明外界因素对试验结果干扰较小[31]。模型的决定系数为R2=0.951 8，表明方程与实际测试数据吻合良好，能较好反映欧李多酚提取量与液料比、酶解时间、酶解温度、超声波功率的关系，该模型可用于分析和预测欧李多酚的提取条件。通过F检验确定回归方程中每个变量对响应值影响的显著性见表3。

2.2.2 响应面试验

根据回归方程制作的响应面立体分析图和等高线图见图5、图6。图5、图6分别反映了4个因素（液料比、酶解时间、酶解温度、超声波功率）两两交互作用对响应值的影响，等高线形状近似圆形表示二者交互作用不明显，近似椭圆形则表示二者的交互作用明显。

表2 响应面试验设计与试验结果Table 2 Design and test results of response surface

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

由图5响应面图看出，酶解时间和酶解温度取0水平时，随着料液比和超声波功率的变化欧李多酚提取量呈先增大后减小的趋势。由等高线图看出料液比比超声波功率区域排列更为紧密，说明料液比对多酚提取量影响更大，等高线图近似椭圆形表示料液比和超声功率之间存在一定的交互作用，对欧李多酚的影响显著[32]。

图5 料液比与超声波功率对欧李多酚提取量的交互影响Fig.5 Interaction effects of liquid-material ratio and ultrasonic power on the extraction amount of polyphenols from cerasus humilis

由图6响应面图看出，在料液比和超声功率取零水平时，随着酶解时间和酶解温度的变化欧李多酚提取量呈先增大后减小的趋势。由等高线看出酶解温度比酶解时间区域排列更为紧密，说明酶解温度对多酚提取量影响更大，等高线图近似椭圆形表示酶解时间和酶解温度之间存在一定的交互作用[33]。

图6 酶解温度与酶解时间对欧李多酚提取量的交互影响Fig.6 interaction effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of polyphenols from cerasus humilis

2.2.3 回归模型的验证

为进一步验证预测值，将预测模型的最佳提取条件进一步验证：超声功率为105 W、酶解温度为50 ℃、酶解时间为 80 min、液料比 30∶1（mL/g），在此条件下重复3次试验，欧李多酚平均提取量为42.63 mg/g，比优化前增加约2 mg/g，与预测值拟合率为99.49%，表明预测值和实际值吻合良好，优化模型可靠。用LSA-5B大孔树脂经动态吸附和解吸附后获得欧李多酚纯化物，总酚含量为73.42 mg/g，表明本试验所确定的优化方案设计合理，获得的提取条件可以显著提高欧李多酚提取量。

2.3 欧李多酚类物质测定

用高效液相色谱仪对提取纯化物的欧李多酚进行测定。欧李多酚类物质主要有没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、咖啡因，其含量见表4。

表4 欧李多酚类物质种类及质量浓度(n=3)Table 4 Types and concentrations of polyphends in cerasus humilis (n=3)

2.4 欧李多酚类物质体外抗氧化活性

2.4.1 欧李多酚的总还原能力

由图7看出，在质量浓度相同的情况下，欧李果实多酚类物质纯化物、粗提物和Vc三者还原能力强弱如下：维生素 C(IC50=35.05μg/mL)＞欧李多酚纯化物(IC50=32.42μg/ mL) ＞欧李多酚粗提(IC50=30.13μg/ mL)。欧李多酚纯化物的还原能力与维生素C差异不显著（P＞0.05），与粗提物差异显著（P＜0.05）。由此可见，纯化过程除去杂质且但不影响主要成分的活性，可提高总还原能力。

图7 欧李多酚总还原能力Fig.7 Total reducing capacity of cerasus humilis polyphenol

2.4.2 欧李多酚清除ABTS·自由基的能力

由图8看出，欧李多酚纯化物、欧李多酚粗提物、维生素C对ABTS·均具有清除能力，且欧李多酚纯化物和欧李多酚粗提物对ABTS·的清除能力相当，但均大于Vc。在质量浓度相同的情况下，欧李果实多酚类物质纯化物、粗提物和 Vc三者清除 ABTS·自由基的能力为：欧李多酚纯化物(IC50=55.45μg/mL)＞欧李多酚粗提物 (IC50=51.12μg/mL) ＞维生素C (IC50=49.87μg/mL)，各组间差异显著（P＜0.05）。

2.4.3 欧李多酚清除DPPH·自由基的能力

由图9看出，在质量浓度相同的情况下，欧李多酚纯化物、欧李多酚粗提物、维生素C对DPPH·均具有清除能力，其中欧李多酚纯化物对DPPH·的清除能力小于Vc但强于欧李多酚粗提物，欧李果实多酚类物质纯化物、粗提物和 Vc三者清除 DPPH·自由基的能力具体为：维生素 C(IC50=115.79μg/mL)＞欧李多酚纯化物(IC50= 110.12μg/ mL)＞欧李多酚粗提物(IC50=98.42μg/ mL)，各组间差异显著（P＜0.05）。

图8 欧李多酚清除ABTS·自由基的作用Fig.8 Scavenging effects of cerasus humilis polyphenol on ABTS·free radicals

2.4.4 欧李多酚清除·OH自由基的能力

由图10看出，当总酚浓度小于100μg/mL时，欧李多酚纯化物清除·OH自由基的能力显著高于欧李多酚粗提物和Vc，但浓度大于100μg/mL时，三者清除·OH自由基的能力相当。但在质量浓度相同的情况下，欧李果实多酚类物质纯化物、粗提物和Vc三者清除·OH自的能力为：欧李多酚纯化物 (IC50=72.65μg/mL)＞欧李多酚粗提物(IC50=66.92μg/mL) ＞维生素 C (IC50=60.42μg/mL)，纯化物与粗提物之间差异不显著（P＞0.05），但纯化物和粗提物与Vc之间差异显著（P＜0.05）。

图10 欧李多酚清除·OH自由基的作用Fig.10 . Scavenging effects of cerasus humilis polyphenol on·OH free radicals

3 讨 论

1）欧李是中国特有的一种野生果树，其果实营养和功能性成分丰富，由于受欧李品种及地域的差异，欧李多酚含量也会有差异。本试验采用单因素及响应面优化试验研究了欧李多酚超声辅助酶解提取工艺。采用了传统提取工艺辅助酶解，这种提取工艺既加快了化学反应速率，又提高了多酚的提取量，但耗能较高。

2）采用大孔树脂纯化欧李多酚粗提物，欧李多酚纯度会受试验器材、人为操作、大孔树脂种类等因素影响。同时利用高效液相色谱法测定酚类物质的种类，也会因为标准品种类受限，有些酚类物质可能未完全比对出来，最后利用分光光度法测定欧李多酚类物质总还原力和对自由基·OH、DPPH·、ABTS·的清除作用，根据欧李多酚的总还原力及抗氧化性结果，纯化过程除去杂质且但不影响主要成分的活性，可提高总还原能力及抗氧化能力。综合来讲，本试验具有较大的实践意义和参考价值。

4 结 论

欧李多酚以超声辅助果胶酶提取为好，经单因素试验及响应面优化试验得到提取最佳工艺参数为：超声波功率105 W、酶解温度50 ℃、酶解时间80 min、液料比30∶1（mL/g）在该条件下多酚提取率为 42.63 mg/g。使用LSA-5B大孔树脂纯化欧李多酚，纯化物中欧李多酚含量73.42 mg/g，纯化效果明显。

从欧李多酚中检测出6种酚类物质，其含量顺序依次为绿原酸＞没食子儿茶素没食子酸酯＞对羟基苯甲酸＞咖啡因＞没食子酸＞原儿茶酸。欧李多酚对 DPPH·、ABTS·、·OH自由基均有良好的清除能力，欧李多酚纯化物清除·OH的 IC50值为 72.65μg/mL，清除 DPPH·的 IC50值为110.12μg/mL，清除 ABTS·的 IC50值为 55.45μg/mL，总还原力EC50值为32.42μg/mL，与Vc作用相当。欧李果多酚粗提物清除·OH 的 IC50值为 66.92μg/mL，清除DPPH·的 IC50值为 98.42μg/mL，清除 ABTS·的 IC50值为49.87μg/mL，总还原力值为 30.13μg/mL。