农杆菌介导遗传转化云蔗05-51*

段智睿 ，吴转娣，姚 丽，覃 伟，吴才文，曾千春

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院 甘蔗研究所，云南 开远 661600)

甘蔗是主要的糖料和能源作物，蔗糖产量占世界食糖总产量的76%、占中国食糖总产量的90%以上。然而，多年来甘蔗单一品种种植引发了病虫害加剧、品种退化、抗逆性差和产量下降等问题，给蔗糖生产带来巨大的经济损失[1]。云蔗05-51 以创新种质崖城90-56 为母本，新台糖23 号为父本，于2013 年通过国家鉴定；该品种综合性状优异，具有良好的适应性、丰产稳产性，早熟高糖、抗寒抗旱性强，田间表现出苗快且整齐、分蘖力强、中大茎、有效茎多和宿根性强等特点[2]。20 世纪70 年代中期，中国开始甘蔗离体快繁工厂化生产，相关技术已经相当成熟[3]。吴转娣等[4]以云蔗05-51 茎芽为起始材料，采用MS 基本培养基添加(0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT)与增殖培养基添加(6-BA 1.0 mg/L+0.5 mg/L KT)等建立了离体快繁系统。但是以云蔗05-51 心叶作为外植体的组培再生体系及其遗传转化系统尚未见报道。

G418 是一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制转座子Tn601 和Tn5 的基因干扰核糖体功能，从而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素[5-7]。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)是在植物转基因工程中被广泛应用的标记基因，该基因来自大肠杆菌(Escherichia coli)的aphA2基因，编码的产物氨基糖苷磷酸转移酶 [APH (3′) Ⅱ-酶]对氨基糖苷类抗生素具有抗性，将nptⅡ基因作为选择标记基因与目标基因一同导入受体植物，可赋予转基因植株对氨基糖苷类抗生素的抗性，用于植物转基因筛选[8-10]。国内有报道甘蔗G418 耐受性的筛选[10-12]，但并没有开展nptⅡ标记基因的遗传转化。为此，本研究以新台糖22(ROC22)为对照，先建立云蔗05-51 组培再生体系，明确G418 的筛选质量浓度，进一步开展农杆菌介导遗传转化其胚性愈伤组织系统，为有益基因导入甘蔗品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云蔗05-51 (YZ05-51)和新台糖22 (ROC22)均来自云南省农业科学院甘蔗研究所，G418 由德国生物科技(BioFroxx)公司生产，农杆菌EHA 105 以及质粒pRPBSCK-35SBt 由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯研究员提供，试验在云南开远云南省甘蔗遗传改良重点实验室完成。

1.2 愈伤组织诱导与继代培养

选择田间生长4～6 个月、健壮状态一致的甘蔗主分蘖，砍取蔗茎顶端50 cm 长(保留4～5 节)，装入塑料袋带回实验室备用。剥去外层成熟叶片，用75%酒精喷洒表面，超净工作台中剥去外层叶鞘，在无菌滤纸上将生长点以上约5～7 cm心叶卷横切成厚度为1 mm 的切段，接种于愈伤诱导培养基上，每皿接种20 个切段，每处理接种15 皿，重复3 次，(25±1) ℃暗培养。云蔗05-51愈伤诱导培养基配方为：MS+2,4-D (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 mg/L)+蔗糖(30.0 g/L)+卡拉胶(8.0 g/L)+活性炭(0.2 g/L)，pH 为5.8。每14 d 继代培养1 次，第56 天统计愈伤组织情况，以分析2,4-D 诱导云蔗05-51 愈伤组织的最佳质量浓度。

愈伤诱导率=产生愈伤组织的外植体数/外植体总数×100%。

1.3 不定芽分化

挑选干燥、结构松散、颜色淡黄和生长旺盛的直径约0.5 cm 的愈伤组织块接种到分化培养基上，每瓶接种10 块，每处理15 瓶，重复3 次，光照培养12 h/d，光强2 300 lx，温度(27±1) ℃。云蔗05-51 分化培养基配方为：MS+6-BA (0.5 和1.0 mg/L)+KT (0.1、0.3 和0.5 mg/L)+蔗糖(30.0 g/L)+卡拉胶(8.0 g/L)，pH 为5.8。每14 d 继代1 次，第56 天统计愈伤组织分化情况，以分析6-BA和KT 分化云蔗05-51 愈伤组织块不定芽的最佳配比。

分化率=分化出不定芽愈伤组织块数/愈伤组织总块数×100%；

死亡率=愈伤组织死亡块数/愈伤组织总块数×100%。

1.4 愈伤组织增殖阶段G418 耐受性筛选

方法参考文献[10]并略有改动。挑选干燥、结构松散和颜色淡黄的直径约0.5 cm 的愈伤组织块接种到含抗生素G418 (0、20、30 和40 mg/L)的愈伤组织增殖培养基中，每皿接种20 块，每个处理15 皿，重复3 次，暗培养，温度(25±1) ℃。以ROC22 为对照，每15 d 继代1 次，第60 天统计愈伤组织成活与抑制情况，以筛选确定云蔗05-51 胚性愈伤组织增殖阶段合适的G418 质量浓度。

成活率=愈伤组织成活块数/愈伤组织总块数×100%；

抑制率=愈伤受抑制块数/愈伤组织总块数×100%。

1.5 不定芽分化阶段G418 耐受性筛选

方法参考文献[10]并略有改动。挑选干燥、结构松散和颜色淡黄的直径约0.5 cm 的愈伤组织块接种到含抗生素G418 (0、10、20、30、40 和50 mg/L) 的分化培养基中，每瓶接种10 块，每个处理接种15 瓶，重复3 次，光照培养12 h/d，光强2 300 lx，温度(27±1) ℃。以ROC22 为对照。每15 d 继代1 次，第60 天统计分化情况，以筛选确定云蔗05-51 胚性愈伤组织不定芽分化阶段合适的G418 质量浓度。

分化率=分化出不定芽的愈伤组织块数/愈伤组织总块数×100%；

抑制率=愈伤受抑制块数/愈伤组织总块数×100%。

1.6 农杆菌转化与抗性植株分化

方法参考文献[13]并略有改动。将含nptⅡ基因的工程菌EHA105 (农杆菌)培养至对数生长期后，加入100 μmol/L 乙酰丁香酮激活Vir基因，并调节工程菌OD660值到约0.6 用于浸染。与此同时，选取生长旺盛的胚性愈伤组织，于超净工作台无菌滤纸上风干至表面呈收缩状，浸入到前述工程菌液中。在低压环境下保持2～4 min，静置5 min，重复2～3 次[14]。滤去菌液，在无菌滤纸上吸干残液并吹干至表面无水膜。转移到MR[13]固体培养基上，(25±1) ℃暗培养2～4 d 后，转移到含G418 愈伤筛选培养基上，(25±1) ℃暗培养。每15 d 继代1 次，直至筛选出G418 抗性愈伤组织。将抗性愈组织转移到含G418 分化筛选培养基上，12 h/d 光照培养，光强2 300 lx，温度(27±1) ℃。每15 d 继代1 次，直至获得抗性芽。将抗性芽转移到无激素的1/2MS 固体培养基上，生根，炼苗移栽。以ROC22 为对照，处理方法相同。

1.7 抗性苗分子检测

选择生长旺盛、浓绿、高4～7 cm 的抗性植株，编号，剪取叶片组织约20 mg，试剂盒提取DNA，PCR 检测nptⅡ基因，目标片段约700 bp。引物序列F1：5′-GAGGCTATCGGCTATGACTG-3′；R1：5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′。PCR 反应体系10.0 μL (模板2.0 μL，F1 和R1 各1.0 μL，EasyTaq酶5.0 μL，ddH2O 1.0 μL)。扩增程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，38 个循环，72 ℃延伸10 min。1.5% 琼脂糖85 V 电泳检测PCR 产物，溴化乙啶染色后用凝胶成像系统扫描。

NPTII ImmunoStrip®Test (Agdia，CatSTX 73000)在蛋白水平的检测方法参照试剂条使用说明但有改动。称取待检测甘蔗植株心叶20 mg，横剪成1～2 cm 长，置于1.5 mL Eppendorf 管中，加400 µL PEB 缓冲液，用塑料棒挤压捣碎叶片直至溶液呈浅绿色。台式离心机10 000 r/min 离心2 min，取上清液300 µL 至1.5 mL 管中，将检测试剂条标有“sample”的一端插入上清液中，静置15 min 并保持下端接触上清液，阳性植株会出现2 条带。

1.8 数据统计分析

数据采用SPSS 20.0 统计软件进行方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s 法检验处理间平均值的显著差异(P＜0.05)，数据表示为“mean±SE”。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

由表1 可知：2,4-D 质量浓度为3.0 mg/L 时愈伤组织的诱导率最高，为97.61%，愈伤组织块直径在1.5 cm 以上，生长状态最佳，结构松散。因此，云蔗05-51 愈伤组织诱导的2,4-D 最佳质量浓度为3.0 mg/L。

表1 2,4-D 对云蔗05-51 愈伤组织诱导的作用Tab.1 Effect of 2,4-D on the callus induction of YZ05-51

2.2 不定芽分化培养

由表2 可知：6-BA 和KT 质量浓度分别为1.0和0.1 mg/L 时愈伤组织块上的不定芽分化率最高，为98.30%，死亡率为0.03%，组织块上有大量不定芽，不定芽高度超过1.5 cm，且愈伤组织结构仍较松散。因此，云蔗05-51 愈伤分化不定芽的6-BA 和KT 最佳用量分别为1.0 和0.1 mg/L。

表2 6-BA 和KT 不同质量浓度配比对云蔗05-51 愈伤组织块分化不定芽的作用Tab.2 Effect of 6-BA and KT combination on the buds generation of YZ05-51 from callus

2.3 G418 对甘蔗愈伤组织生长的影响

由图1 可知：当G418 质量浓度为30 mg/L 时，ROC22 愈伤组织的生长完全受到抑制；当G418质量浓度为40 mg/L 时，YZ05-51 愈伤组织生长的成活率接近0。相同培养环境下，云蔗05-51愈伤成活率要高于ROC22，抑制率低于ROC22，说明在愈伤组织阶段ROC22 对G418 较YZ05-51 更敏感。

图1 不同G418 质量浓度下云蔗05-51 和ROC22 愈伤组织诱导的成活率和抑制率Fig.1 The survival rates and inhibition rates of callus induction of YZ05-51 and ROC22 at different mass concentrations of G418

2.4 G418 对甘蔗愈伤组织块不定芽分化的影响

由图2 可知：当G418 质量浓度为20 mg/L 时，ROC22 愈伤组织块上不定芽的分化率接近0；当G418 质量浓度为30 mg/L 时，YZ05-51 愈伤组织块上不定芽的分化率接近0。相同培养环境下，云蔗05-51 不定芽分化率要高于ROC22，抑制率低于ROC22，说明在不定芽分化阶段ROC22 对G418 较YZ05-51 更敏感。

图2 不同G418 质量浓度下云蔗05-51 和ROC22 愈伤组织块不定芽分化的分化率和抑制率Fig.2 The differentiation rates and inhibition rates of YZ05-51 and ROC22 buds generation from callus at different mass concentrations of G418

2.5 抗性苗分子检测

由图3 可知：PCR 检测的15 株抗性植株(9 株为YZ05-51，6 株为ROC22) 中，11 株扩增出与预期大小700 bp 相符的片段，阳性植株率达73.3%，说明G418 筛选效果较好，且nptⅡ基因已整合到抗性植株基因组中。NPTⅡ蛋白检测结果(图4) 显示：受检测的4 株抗性植株中的3 株出现2 条带，表明nptⅡ基因蛋白水平正常表达。

3 讨论

图3 筛选标记基因nptII 的PCR 检测Fig.3 PCR detection of marker gene nptII

图4 抗性植株NPTII 蛋白检测Fig.4 NPTII ImmunoStrip® test of the G418 resistant plants

本试验中G418 达到抑制YZ05-51 愈伤组织增殖和不定芽分化的质量浓度分别为40 和30 mg/L，完全抑制ROC22 愈伤组织增殖和不定芽分化的质量浓度分别为30 和20 mg/L，与林美娟等[12]研究得出的同品种甘蔗在不同组培阶段对G418 的耐受性不同以及不同品种在相同组培阶段对G418 耐受性存在明显差异的结论相符。在G418对ROC22 影响的试验中，刘家仪等[11]研究表明：ROC22 愈伤组织增殖和分化阶段完全受到抑制的G418 用量分别为20 和30 mg/L，与本研究结果相反，也与林美娟等[12]的总体趋势结论相反。

农杆菌介导已成功转化水稻[15]、玉米[16]和甘蔗[17]等禾本科植物，采用的筛选标记基因分别为bar(水稻和玉米)和pmi基因，其相应的筛选试剂分别为除草剂和甘露糖。nptⅡ标记基因被广泛应用于植物转基因研究，氨基糖苷类抗生素作为其常用的筛选剂，在番茄[18]和梨[19]的应用中已有成功报道。本研究采用农杆菌介导法结合G418筛选，成功地将nptⅡ基因导入云蔗05-51，抗性植株nptⅡ基因PCR 检测阳性率为73.3%；NPTⅡImmunoStrip 检测表明：nptⅡ在蛋白水平正常表达，为有益基因导入云蔗05-51 和其他甘蔗品种奠定了基础。