尿毒康通过抑制p38/ERK MAPK通路改善UUO大鼠肾小管细胞上皮-间质转化*

2021-01-26 03:43江茜王宏王蕾康利李燕林
天津中医药 2021年1期
关键词:肾小管纤维化肾功能

江茜 ,王宏 ,王蕾 ,康利 ,李燕林

(1.天津市医药科学研究所,天津 300020;2.中山市中医院,中山 528400)

近年来,慢性肾脏病(CKD)的发病率呈上升趋势,CKD常合并贫血、骨代谢异常、心血管并发症等多种并发症,严重影响患者的生理状态和生活质量,并增加患者的死亡风险[1-2]。肾纤维化是CKD的主要病理改变,是由肾小球硬化和肾小管间质纤维化之间的不平衡,细胞外基质(ECM)合成过多引起[3],包括肾小球硬化(GS)、肾间质纤维化(TIF)和血管硬化。其典型病理表现为肾小球内固有细胞数量减少、细胞外基质过度沉积、肾间质成纤维细胞增生及间质毛细血管丧失[4]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一种胞浆内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在真核细胞中,由4条平行的信号转导通路组成,即细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和应激活化蛋白激酶(SAPK)通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路和细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)/大丝裂原活化蛋白激酶1(BMK1)通路[5]。最新的研究发现,ANGPTL2通过MEK/ERK/Nrf-1途径调节自噬并影响糖尿病性肾病肾纤维化的进展[6]。Roscovitine通过重组人转化生长因子-β(TGF-β1)/p38MAPK途径减轻糖尿病小鼠的肾间质纤维化[7]。

中医中药在预防和治疗CKD中发挥日益重要的作用[8]。百日草(RDP)通过经典和非经典的转化生长因子TGF-β信号转导途径改善了单侧输尿管结扎法(UUO)诱导的肾纤维化[9]。清肾补阳方通过抑制上皮间质转化(EMT)和Wnt/β-Catenin途径减轻5/6肾切除大鼠的肾纤维化[10]。芪丹地黄汤通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)途径减轻糖尿病肾纤维化[11]。肾康注射液可减轻阻塞性肾病中的肾小管间质纤维化[12]。当归芍药散通过调节缺氧和自噬减轻肾脏纤维化[13]。黄葵胶囊通过抑制NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)炎性小体和激活Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号传导,减轻糖尿病肾病的肾小管EMT,抑制肾纤维化[14]。尿毒康是中山市中医院自主研发的中药制剂,从1992年开始即以汤剂在临床中使用。该药由大黄、丹参、黄芪、红花、地榆等药物组成,黄芪益气健脾为方中主药,配伍红花、丹参活血化瘀,大黄泻浊逐瘀以通肾络,地榆凉血解毒,诸药相合,扶正祛邪,攻补相宜。尿毒康针对慢性肾功能衰竭湿浊内留,气虚血瘀的本虚标实之病机,具有祛湿浊,通肾络,益气健脾的功效。动物实验发现尿毒康合剂能够降低慢性肾功能衰竭大鼠的血清肌酐(SCr)和尿素氮含量,调节脂质代谢,改善肾功能[15]。临床试验发现,尿毒康能降低患者SCr水平,改善肾功能,延缓终末期肾病发展[16-19]。尿毒康能增强机体的排毒能力,减轻肾损伤改善肾功能衰竭[18,20]。然而,尿毒康改善肾纤维化的具体机制至今没有研究。因此,文章通过单侧输尿管结扎法,构建大鼠肾纤维化模型,考察尿毒康改善肾纤维化的机制。

1 实验方法

1.1 UUO复制肾间质纤维化模型 大鼠体质量(208.60±6.05)g,45 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,右侧卧位固定于手术台上,剪毛后用碘酊-75%乙醇消毒手术区,行左侧腹切口,逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层,暴露并分离左侧输尿管,手术线结扎两道,然后在两道结扎点间剪断输尿管,逐层缝合。假手术组仅切开腹腔,游离左侧输尿管,但不结扎和剪断。

1.2 分组及给药 将UUO大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、阳性药对照组(氯沙坦钾片,30 mg/kg,10 mL/kg,相当于临床给药剂量的6倍)、尿毒康20 mL/kg组、10 mL/kg组和5 mL/kg组(分别相当于临床给药剂量的12倍、6倍和3倍)。手术第2天开始给药。假手术组和模型组灌胃给予等体积纯净水,每日1次,连续21 d。各实验组大鼠10只。实验过程中模型组死亡大鼠2只,尿毒康高剂量死亡大鼠3只,低剂量死亡大鼠1只。假手术组、阳性药对照组、尿毒康中剂量组未见死亡大鼠。

1.3 尿液和血清生化检测 末次给药后,收集大鼠24 h尿液,测定24 h尿蛋白。45 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清,检测SCr水平。

1.4 组织病理学观察 取结扎侧肾脏(左侧),纵向剖开,10%中性甲醛固定,制成石蜡切片。苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠肾组织的病理改变。Masson染色观察纤维化程度。Masson染色后,显微镜下观察,随机选取10个视野,按病变面积占该视野的百分比评分,无计0分、小于25%计1分、25%~50%计2分、大于50%计3分。

1.5 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TGF-β和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达 取肾脏组织剪碎后加入1 mL Trizon后反复吹打,使样本充分裂解。加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,室温放置2min。4℃12000r/min离心15min,离心半径8cm,取上层水相层。加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置10 min。4℃12 000 r/min离心10 min,弃上清。加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。4℃12 000 r/min离心5 min,离心半径8 cm,弃上清,挥干。加入30 μL无RNase的水溶解。根据HiFiScript g DNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪,Cat:CW2582M)说明书配制反应体系,42℃15 min,85℃5 min逆转录为cDNA。根据 UltraSYBR Mixture(Low ROX)(康为世纪,Cat:CW2601M)进行实时定量反应:预变性95℃5 min,(变性 95 ℃ 15 s,退火 60 ℃ 1 min,延伸 72 ℃30 s)45 cycles,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。2-ΔΔCt计算 mRNA 的相对变化。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.6 Western Blot检测p38,ERK蛋白的表达 取肾脏组织,磷酸盐缓冲液(PBS)洗净,加入蛋白裂解液,充分裂解后,4℃12 000 r/min离心15 min,离心半径8 cm,取上清液,蛋白定量,变性后进行SDSPAGE电泳。电泳结束后,甲醇活化PVDF膜,按滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序组装;组装完成后按PVDF膜在正极,凝胶在负极,置于转膜槽中,200mA恒流转2h。5%脱脂奶粉室温闭1h。一抗p38(CST,1∶1 000),ERK(CST,1∶1 000),β-actin(CST,1∶1 000),4 ℃孵育过夜。1×TBST 洗3次,每次5min;二抗(HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体,1∶3 000),室温2 h,洗膜,ECL成像系统发光显影,采用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析,两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿毒康能改善UUO大鼠的肾功能 对各组大鼠24 h尿蛋白含量进行检测,发现与假手术组相比,UUO模型大鼠 24 h尿蛋白明显升高(P<0.01),见图1A;与模型组相比,阳性药对照组和尿毒康组较UUO模型大鼠 24 h 尿蛋白定量水平(P<0.05 或 P<0.01)明显降低,其中尿毒康10 mL/kg组下降明显。随后,检测了大鼠SCr的变化,发现模型组SCr水平明显升高(P<0.01),见图 1B;与模型组相比,阳性对照组和尿毒康组SCr水平明显降低(P<0.01)。说明尿毒康能够改善UUO大鼠的肾功能。见图1。

2.2 尿毒康能明显改善肾脏纤维化 大体观察发现:假手术组肾脏大小正常,表面光滑,切面见肾实质厚度正常,皮髓质分界清晰,未见肾盂、肾盏扩张;模型组肾脏体积增大,成囊状,肾切面可见实质菲薄,皮、髓质分界不清,肾盂和肾盏高度扩张、变形。尿毒康各剂量组和阳性药对照组肾脏体积增大较模型组小,肾盂和肾盏高度扩张、变形程度轻。肾组织HE染色发现:假手术组肾小球体积未见缩小或肥大,数目未见减少,肾小管上皮细胞未见变性、坏死或脱落,管腔中未见管型及结石,肾间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生;模型组肾小管广泛萎缩及代偿扩张,部分区域可见肾实质细胞明显减少,多数肾小囊增宽,并出现部分肾小球的崩解,大多数肾小管萎缩,上皮细胞变性坏死,局部管腔扩张明显,髓质区失去放线结构,伴有大量炎细胞浸润。尿毒康各剂量组和阳性药对照组病理表现较模型组肾小球形态、肾小管形态、肾间质、炎细胞浸润方面有所改善。其中尿毒康10 mL/kg组在间质纤维化程度方面改善相对明显。见图2A。

Masson染色发现:模型组肾间质增宽、间质成纤维细胞大量增生,胶原纤维形成。半定量分析显示模型组肾间质纤维化程度明显高于假手术组(P<0.01);尿毒康10mL/kg组能够明显减轻UUO大鼠肾间质纤维化程度(P<0.01)。见图 2B 和 2C。

随后,qRT-PCR检测了纤维化关键因子TGF-β和α-SMA的mRNA的表达,发现UUO模型大鼠TGF-β,α-SMA mRNA表达增加,而尿毒康组较UUO模型组TGF-β,α-SMA mRNA表达表达下降。以上结果表明尿毒康能够明显改善肾纤维化,且尿毒康10 mL/kg作用最明显。见图2D。

2.3 尿毒康抑制p38/ERK MAPK通路改善肾纤维化 为了进一步研究尿毒康改善肾纤维化的机制,检查了MAPK通路关键蛋白p38,ERK的表达,发现UUO模型大鼠p38,ERK的表达增加,而尿毒康组较模型组p38,ERK表达下降。说明尿毒康改善肾纤维化可能与抑制了p38/ERK MAPK通路有关。见图3。

3 讨论

图1 尿毒康对UUO大鼠肾功能的影响Fig.1 Effect of Niaodukang on renal function of UUO rats

图2 尿毒康对UUO大鼠肾脏纤维化的影响Fig.2 Effect of Niaodukang on renal fibrosis significantly of UUO rats

图3 尿毒康对MAPK通路的影响Fig.3 Effect of Niaodukang on MAPK pathway

中医学中没有肾纤维化的病名,但从肾纤维化形成的病理基础来看,其与血瘀证密切相关,具体为脏腑功能虚损,脾肾虚为主,兼有浊毒内阻,病情逐步发展而加重,最后导致正气虚衰,浊邪阻滞。研究发现,清肾补阳方[10]、芪丹地黄汤[11]、当归芍药散[13]等在防治肾纤维化方面具有显著的效果,显示了中医药在治疗肾纤维化应用中的良好前景。尿毒康由大黄、何首乌、女贞子、黄芩等药组成,具有益气温阳,健脾益肾,活血泻浊的功能,切中慢性肾功能衰竭脾肾气(阳)虚为本,湿浊瘀血为标的病机。大黄具有泻湿浊、逐瘀血、荡涤胃肠、清热解毒之功效,此外,大黄还具有抗菌,抗凝,降血黏,改善氨基酸、脂质代谢,抑制肾小球系膜细胞等作用,故大黄长期以来用于慢性肾功能衰竭的治疗。丹参中的成分Magnesium Lithospermate B能提高肾组织活性氧清除酶活性,抑制过氧化脂质丙二醛(MDA)的产生,从而改善肾小球滤过、肾小管重吸收功能。丹酚酸A通过抑制NF-κB和p38 MAPK信号通路来减轻5/6肾切除大鼠的肾脏损伤和炎症[21]。丹参和红花协同活瘀血、通肾络,增加尿量,加速毒素从尿中排泄。黄芪具有健脾益气,扩张血管,改善肾血流,促进蛋白质合成的作用。诸药合用,具有化瘀解毒、利湿泻浊、健脾益气功效。本实验首先通过单侧输尿管结扎,成功复制了大鼠肾纤维化模型,通过灌胃给与不同浓度的尿毒康,证实了临床等效剂量的尿毒康能够明显改善UUO大鼠的肾小管细胞上皮-间质转化。在进一步的机制探讨中发现,尿毒康能够降低TGF-β的表达,TGF-β为肾纤维化进展的重要因子。已有研究发现TGF-β上调ERK途径,导致肾小管细胞胶原沉积和肾纤维化[22]。于是通过Western Blot检测了p38与ERK的表达,发现模型组p38与ERK表达增加,尿毒康组p38与ERK表达下降。p38与ERK是MAPK通路的关键蛋白,p38 MAPK通路为控制炎性反应最主要的MAPK家族成员之一,可被TGF-β激活,参与应激条件下的细胞凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎性反应过程。本实验发现给予尿毒康后,p38与ERK表达降低,MAPK通路抑制,因此,尿毒康能够通过抑制p38/ERK MAPK通路改善肾小管细胞上皮-间质转化的肾纤维化。但是尿毒康能否改善其他脏器的纤维化,扩大尿毒康的临床应用仍需进一步的研究。

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