HPLC同步测定秃疮花中紫堇丁碱同分异构体的含量

倪居，田野，张效斌，高金鑫，张卫，周乐

1. 郑州铁路职业技术学院（郑州 451460）；2. 河南职业技术学院烹饪食品与健康学院（郑州 450046）；3. 西北农林科技大学化学与药学院（杨陵 712100）

秃疮花[Dicranostigma leptopodum（maxim.）Fedde，DLF][1]，又名滇川秃疮花、秃子花、红茂草、勒马回（陕西），属于罂粟科秃疮花属。带根全草民间供药用，春夏采集，晒干；性凉，苦涩味，有毒；有清热解毒、消肿止痛、杀虫的功效；用于治疗扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、淋巴结核，主治咽喉痛、扁桃体炎、齿龈肿痛、秃疮、瘰疬、疖疮、寻常疣、疥癣、痈疽、头癣、体癣等。现代药理研究证明，传统中草药秃疮花提取物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、杀虫等多种药理活性[2-4]。秃疮花化学成分主要为多种异喹啉类生物碱[5]。其中，生物碱包括阿朴啡型、原小檗碱型、原阿片碱型，对癌细胞系如SMCC-7721、A549、HT-29、KB和p388等癌细胞具有较强的细胞毒性，可抑制癌细胞增殖[6]，可能是秃疮花抗肿瘤活性的物质基础。

工艺研究指出异紫堇丁碱在该植物中的含量较高[7]，并且具有强的抗肿瘤活性。然而有关同步提取分离和HPLC同步测定紫堇丁碱同分异构体的方法未见文献报道。试验采用超声提取法和硅胶柱层析法分离纯化紫堇丁碱和异紫堇丁碱，通过HPLC同时测定其含量，以期为秃疮花的有效利用和资源开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

秃疮花为花期全草，2018年5月采自陕西省西北农林科技大学北校园区。经过西北农林科技大学苗芳教授鉴定为秃疮花（Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde）。自然风干，粉碎后用孔径0.150 mm筛筛分，密封，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试验试剂

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、氨水、氢氧化钠等（分析纯，天津市津东天正精细化化学试剂厂，天津市富宇精细化工有限公司）；48～74 μm氧化铝、GF254薄层层析硅胶、74～149 μm和48～74 μm柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）；0.5% CMC、110 ℃活化GF254薄层层析硅胶（自制）；羧甲基纤维素钠（CMC）（南京化学试剂公司）；75%乙醇、95%工业乙醇（山东安捷高科公司）；色谱纯甲醇（德国默克）；超纯水（上海和泰）。

1.3 主要试验仪器

KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JPCT-20L型超声提取器（无锡久平仪器有限公司）；WFH-203三用紫外分析仪（上海光谱仪器有限公司）；BC-R206型旋转蒸发器（上海贝凯生物化工设备有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HPLC（Waters公司）；C-18反相色谱柱（Merk公司）；CP224C万分位电子分析天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；YP30002电子天平（上海越平科学仪器苏州制造有限公司）。

E2695 Waters高效液相色谱仪；1525-2707 TCM-2489色谱系统（Water 1525 Binary HPLC Pump，Water 2707 Autosampler，Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Breeze电脑程序系统。

1.4 提取分离试验方法

将秃疮花全草药材干燥粉碎，取其干粉400 g，用2 000 mL体积分数95%乙醇，在常压下按照1∶5（g/mL）的固液比超声波提取3次，45 ℃，每次1 h，过滤，合并滤液，50 ℃减压回收溶剂，制得乙醇提取物用水充分混悬后，依次用极性由小到大的不同溶剂萃取。用等量石油醚溶剂连续萃取3次，混合萃取液，并减压蒸馏除去石油醚溶剂，得石油醚萃取相浸膏，剩余水相，加入盐酸进行酸化（pH 1～2），用等量氯仿溶剂萃取3次，合并萃取液，减压除去氯仿溶剂，得酸化氯仿相。取1.00 g秃疮花酸化氯仿相，用48～74 μm硅胶柱层析和中性Al2O3柱层析（规格：35 mm× 280 mm），洗脱剂依次为V（CHCl3）∶V（CH3OH）= 15∶1～8∶1，分离得到196.9 mg紫堇丁碱和488.6 mg异紫堇丁碱[8]。紫堇丁碱占酸化氯仿相的19.7%，异紫堇丁碱占酸化氯仿相的48.9%，两者合计共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要有效成分。

2 含量测定

2.1 供试样品及浓度配制

实时提取物[9]：称取5 g秃疮花全草粉末，用95%工业乙醇，于50 ℃超声提取，提取3次，每次1 h，制得0.855 g醇提物，命名为TCH-1。

秃疮花中生物碱类化合物紫堇丁碱（Cor）、异紫堇丁碱（Iso-Cor）均为研究分离、提取和纯化的单体化合物。

称取相应量的醇提物和单体化合物，用色谱甲醇溶解，并用0.22 μm超滤膜过滤，配制成相应浓度的甲醇溶液。生物碱单体化合物浓度和醇提物浓度配制梯度见表1和表2所示。

表1 秃疮花生物碱类单体化合物浓度梯度配制表

表2 秃疮花醇提物浓度梯度配制表

2.2 定量分析方法[10-11]

采用HPLC（1525-2707 TCM-2489色谱系统）、柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水洗脱体系，洗脱方法为：0～5 min用10%甲醇-水体系溶液平衡柱子，5～35 min由10%甲醇水溶液过渡到100%甲醇体系，进行10%甲醇-100%甲醇体系梯度洗脱，45～48 min由100%甲醇过渡为10%甲醇-水体系，48～50 min用10%甲醇-水体系平衡柱子。上样量1 mL，进样体积10 μL，每个样品运行检测时间为50 min，柱温30 ℃，检测波长260 nm。

2.3 醇提物和单体化合物的保留时间与峰值

图1为10 g/mL秃疮花乙醇提取液HPLC分析色谱图，横轴是保留时间（单位是min），纵轴是电信号（单位是Au）。在保留时间22 min时有高强度色谱峰。图2为同一条件下紫堇丁碱和异紫堇丁碱的色谱图，其保留时间与秃疮花醇提物一致。

2.4 含量分析

单体化合物的含量计算方法：设单体化合物的浓度梯度，经HPLC分析，建立积分面积与浓度之间关系的回归方程、线性关系和保留时间（见图5和表3）；将醇提物中该物质在某一浓度（如10 mg/mL）下的峰面积（y）代入回归方程，计算出该物质的质量浓度x（mg/mL）；将x带入物质的含量计算公式，可得该单体化合物在原材料中的含量（注：根据前期试验，提取率按照平均为17%进行计算）。秃疮花中紫堇丁碱含量为0.79%、异紫堇丁碱含量为1.33%。

图1 秃疮花醇提物（10 mg/mL）的保留时间以及吸光度峰值

图2 紫堇丁碱和异紫堇丁碱的保留时间以及吸光度峰值

图3 紫堇丁碱和异紫堇丁碱的积分面积与浓度线性回归方程和关系图

表3 2种生物碱单体化合物的线性回归方程和保留时间

3 讨论

利用峰面积与单体化合物浓度之间线性回归方程和物质的含量计算公式，计算出单体化合物在各自原材料中的含量。异紫堇丁碱占酸化氯仿相的48.9%，紫堇丁碱占酸化氯仿相的19.7%，两者合计共占酸化氯仿相的68.6%；建立积分面积与浓度之间关系的回归方程，紫堇丁碱y=16 369 907.7x-393 024.811（R2=0.999 872 719），秃疮花中紫堇丁碱含量为0.79%；异紫堇丁碱y=13 281 438.44x-36 671.693 15（R2=0.999 834 091），秃疮花中异紫堇丁碱含量为1.33%。

4 结论

建立秃疮花中紫堇丁碱和异紫堇丁碱的同步提取分离制备方法，采用HPLC研究药用植物秃疮花中分离得到的同分异构体在植物中的含量，并与粗提物保留时间对比定位，检验试验工艺的可行性，初步建立HPLC同时测定生物碱的检测方法。为进一步研究秃疮花的药理活性和构效关系提供试验数据，为药食同源植物中单体化合物含量的定量测定奠定试验基础和理论依据。