基于DPPH-HPLC的食凉茶抗氧化组分的快速筛选及分析

许平翠 张晓芹 陈礼平 王娜妮*

(1. 浙江省中医药研究院，杭州 310007；2. 丽水市中医院，丽水 323000)

食凉茶是畲族常用药材，为腊梅科植物柳叶蜡梅Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu和浙江腊梅Chimonanthus Zhejiangensis M. C. Liu的干燥叶[1]。据《浙江省中药炮制规范》2015年版收载，食凉茶具有清热解毒、健脾益气等功效[2，3]。现代研究表明，食凉茶中主要含有挥发油、香豆素、黄酮、以及生物碱等有效活性成分[4]。研究表明，食凉茶具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[5]。DPPH自由基在517nm有强吸收，与自由基清除剂反应可使吸收减弱或消失[6，7]，已有研究将DPPH-HPLC法用于筛选中药抗氧化活性成分[8，9]，目前尚无关于DPPH-HPLC法快速筛选食凉茶抗氧化活性的报道。

1 仪器与材料

SHZMADZULC-20AT高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(PDA)；KQ-400DE型数控超声波清洗器；HC-2518高速离心机；AE-50电子天平；多功能粉碎机；MAX190酶标仪；XMTD-8222恒温水浴锅。对照品：槲皮素(批号MUST-14082610)，东莨菪内脂(批号BWB50099)，山奈酚(批号BWB50802)均购于北京世纪奥科生物技术有限公司；DPPH(≥97%，批号RQ18R305)购于上海瑞永生物科技有限公司；抗坏血酸(VC，批号20130413)购于广东光华科技股份有限公司；娃哈哈纯净水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。食凉茶经副任中药师林娜鉴定，为腊梅科植物柳叶蜡梅Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

称取食凉茶粉末约5.0g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加10倍水，回流提取2次，每次1h，合并滤液，浓缩并定容至50mL，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

取东莨菪碱、芦丁、东莨菪内酯、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚对照品适量，精密称定，加甲醇配制成1mL含东莨菪碱0.025mg、芦丁0.010mg、东莨菪内酯0.0290mg、滨蒿内酯0.0120mg、槲皮素0.010mg、山柰酚0.010mg的混合溶液，备用。

2.3 色谱条件

EclipseXDB-C18色谱柱( 250mm×4.6mm，5μm) ，流动相为乙腈( A) -0. 1%甲酸水( B) ，梯度洗脱：0～10min，90%B；10～15min，90%-85%B；15～30min，85%-80%B；30～50min，80%-50%B；50～55min，50%B，流速为1.0mL/min，柱温30℃，波长254nm，进样量10μL。

2.4 食凉茶提取物的DPPH自由基清除率测定

将2mL供试品溶液加入到2mL的80μg/mL DPPH甲醇溶液中，室温避光孵育30min，在517 nm波长下，测其吸光度As，同时测定2mL甲醇与2mL的DPPH溶液孵育后的吸光度Ac，以及2mL供试品溶液与2mL的甲醇孵育后的吸光度Ab，按公式计算DPPH清除率。DPPH清除率(%)=[1-(As-Ab)/Ac]×100

2.5 DPPH-HPLC筛选条件优化

DPPH-HPLC筛选方法受到反应时间、DPPH浓度、食凉茶提取物和DPPH体积比等多种因素影响，为保证筛选结果的准确度和准确性，对关键影响因素进行优化，80μg/mL VC溶液作为对照，结果见图1。由图可知，食凉茶提取物和80μg/mL DPPH甲醇溶液等体积避光反应30min，DPPH清除率较高。

图1 DPPH-HPLC筛选条件优化

2.6 DPPH-HPLC用于抗氧化活性物质的快速筛选

按“2.4”方法制备供试品样品和对照样品，13000r/min，离心10min，取上清液，微孔滤膜过滤，进行高效液相色谱分析，比较各个成分峰面积的改变，以峰强度减少大于80%的成分被认定为潜在的抗氧化活性物质。结合对照品，结果见图2。东莨菪碱、芦丁、滨蒿内酯峰强度稍有减小，而东莨菪内酯峰强度显著减小，槲皮素、山奈酚消失，推测其DPPH自由基清除活性较强。

图2 食凉茶提取液DPPH-HPLC色谱图和峰强度对比图1.东莨菪碱；2.芦丁；3.东莨菪内酯；4.滨蒿内酯；5.槲皮素；6.山奈酚

2.7 抗氧化活性成分分析

2.7.1抗氧化活性成分含量测定

将混合对照品溶液配置成系列浓度的混合对照品溶液进行HPLC分析，以各成分的峰面积(Y)对样品浓度(X)绘制标准曲线，得线性回归方程分别为东莨菪内酯Y=16074X-6155.2(r=0.9996)，槲皮素Y=39901X-13908(r=0.9999)，山奈酚Y=28558X-17224(r=0.9995)。取混合对照品溶液进行精密度考察，精密度的RSD分别小于2.0%，表明仪器精密度良好。精密称取5.0食凉茶粉末，按“2.1”方法制备供试品溶液，进行稳定性、重复性、加样回收率考察，得稳定性、重复性RSD分别小于2.0%，表明样品稳定性及本方法重复性良好；加样回收率分别为97.67%、86.61%、86.71%，RSD分别为0.34%、0.25%、0.53%。最后，测定食凉茶样品，计算其含量分别为0.106mg/g、0.165mg/g、0.156mg/g。

2.7.2活性成分的抗氧化能力评价

将筛选出的抗氧化活性成分进行体外抗氧化活性评价。取东莨菪内酯、槲皮素、山奈酚、VC用甲醇配成系列浓度的对照品。按“2.4”方法计算DPPH清除率，并计算EC50值(清除50%DPPH时所需要的浓度)。结果见图3。可以看出东莨菪内酯、槲皮素、山奈酚均有较强的DPPH自由基清除能力，可能是食凉茶发挥抗氧化作用的重要药效物质。

图3 东莨菪内酯、槲皮素、山奈酚、VC的DPPH自由基清除率与EC50结果

3 讨论

食凉茶中槲皮素属于黄酮醇类成分，具有抗氧化、抗菌等多种生物活性，山奈酚属于黄酮类成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，东莨菪内酯属于香豆素类成分，具有较好的体外抗氧化活性。本实验建立了DPPH-HPLC方法快速测定食凉茶中抗氧化活性成分并同时分析其抗氧化能力，避免了传统分离制备及抗氧化实验操作繁琐、耗时的缺点，能够快速、简便、灵敏分析抗氧化活性成分。建立HPLC方法同时测定3种抗氧化活性成分，建立的方法简便可行，准确度高、灵敏度号，为食凉茶抗氧化功能的质量评价提供实验依据。