DNA甲基转移酶3b对乳腺癌细胞微小RNA表达的影响

（北华大学医学技术学院实验中心，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，严重危害女性健康。乳腺癌的发生发展常受到多种基因的调控（原癌基因的激活和抑癌基因的失活），同时也受到一些表观遗传学因素［DNA甲基化和微小RNA（microRNA，miRNA）等］影响［1-3］。其中DNA甲基化的发生不仅可以影响肿瘤相关基因的表达变化，而且对位于CpG岛附近或位于CpG岛中的miRNA表达产生影响［4-6］。本研究探讨抑制DNA甲基化和siRNA干扰DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b，Dnmt3b）后乳腺癌细胞MCF-7中miRNA和肿瘤相关基因的表达情况，旨在为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞生物学研究所，DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国HyClone公司，转染试剂购于美国QIAGEN公司，RNA提取、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购于日本TaKaRa BIOINC公司，GAPDH抗体、DNA甲基化抗体购于英国Abcam公司，二抗购于中国博士德公司，抗荧光淬灭剂、Hoechst33258购于德国Sigma公司。siRNA由上海吉玛公司合成，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光染色检测MCF-7细胞甲基化水平：将盖玻片过酸处理高压灭菌后，放入24孔板中，接种MCF-7细胞，24 h后实验组分别加入5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR），终浓度分别为5-Aza-CdR 10、5、1 μmol/mL；对照组加入等体积PBS，每24 h加入1次5-Aza-CdR，同时更换培养液，连续处理4 d。4 d后取出盖玻片，PBS清洗3次，用5%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次。用TritonX-100（0.2%）透化40 min，盐酸（4N）酸化30 min，弃去液体后，用Tris盐酸（pH8.0）中和20 min，PBS清洗3次。BSA（1%）4 ℃封闭过夜后，加入适量5-甲基胞嘧啶直接荧光抗体（1%BSA 1∶50稀释），避光放置4 ℃过夜，PBS清洗3次，每次30 min。在适量Hoechst33258染色液（5 mg/L）中避光染色10 min，PBS避光清洗3次，每次5 min。将含抗荧光淬灭剂的封片剂DABCO滴于载玻片上封片，30 min内荧光倒置显微镜下观察，拍照并记录。

1.2.2 siRNA转染及细胞生长曲线绘制：MCF-7细胞用含有10%胎牛血清和90%DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2中培养。实验分为空白对照组（Mock组）、阴性对照组（NC组）和干扰组（siRNA组）。针对Dnmt3b的siRNA-1511及其阴性对照序列如下：5’-CGCCUC AAGACAAAUUGCUTT-3 ’；5’-AGCAAUUUGUCUU GAGGCGTT-3’。转染前1 d将细胞按照1×105/mL接种于24孔板中，每孔加入1 mL培养液。过夜贴壁后，每孔更换为400 μL无血清培养液待用。用100 μL无血清培养液稀释80 ng siRNA，与3 μL转染试剂混匀，室温静止5～10 min，轻轻将转染复合物滴加至24孔板中，轻轻摇匀，转染6 h后荧光显微镜下观察转染情况，计算转染效率。48 h后提取RNA检测目的基因表达情况，96 h后检测miRNA与相关基因表达情况。转染前后连续5 d显微镜下计数细胞，绘制细胞生长曲线。

1.2.3 qRT-PCR检测siRNA干扰后细胞Dnmt3bmRNA的表达：转染48 h后提取NC组、Mock组、siRNA组细胞RNA逆转录，获得的cDNA进行qRT-PCR扩增Dnmt3bmRNA，β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，引物序列见表1。

1.2.4 Western blotting检测siRNA干扰后细胞Dnmt3b蛋白的表达：收集Mock组、NC组、siRNA组细胞，加入RAPI细胞裂解液，4℃裂解10 min，其间涡旋振荡2次，30 s/次，4℃离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。调蛋白浓度一致，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜。封闭后加入Dnmt3b单克隆抗体（1∶100稀释），内参加入兔抗-GAPDH抗体（1∶200稀释），慢摇1 h，用PBS-T洗膜3次，每次20 min。加入二抗（Dnmt3b 1∶3 000稀释；GAPDH 1∶2 000稀释），室温孵育40 min，PBS-T洗膜1次，PBS洗膜2次，每次10 min。在显影仪中滴加显影液显影，用Image J软件对蛋白表达条带进行光密度值的定量分析。

1.2.5 高通量测序检测miRNA的表达情况：将细胞按1×105/mL接种于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM，3孔/组，分为实验组和对照组，实验组每孔加入终浓度5 μmol/mL的5-Aza-CdR，换液1次/24 h，并重新加入5-Aza-CdR。72 h后每孔加入1 mL Trizol将细胞完全裂解，miRNA高通量测序委托上海吉玛公司进行。

1.2.6 qRT-PCR检测mRNA和miRNA的表达：采用Trizol法提取RNA，检测浓度与质量，进行逆转录，qRT-PCR扩增，退火温度及引物序列见表1、表2。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算各基因相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计处理。计量资料用表示，组间比较采用t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the study

表2 miRNA引物序列Tab.2 Sequences of the primers targeting miRNA sequences used in the study

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对细胞DNA甲基化水平的影响

荧光显微镜观察MCF-7甲基化程度，结果可见，随着5-Aza-CdR浓度的升高，5-甲基胞嘧啶甲基化抗体染色逐渐减弱，表示其整体甲基化水平逐渐降低。与对照组（59.37±8.45）比较，1、5、10 μmol/mL组（分别为34.30±9.47、5.11±2.78、4.99±2.64）甲基化水平均有统计学差异（均P＜ 0.05），但5 μmol/mL组与10 μmol/mL组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），因此后续实验选用5 μmol/mL浓度5-Aza-CdR，见图1。

2.2 siRNA转染后细胞生长及Dnmt3b的表达

Western blotting结果显示，siRNA干扰组中Dnmt3b的表达低于Mock组和NC组（P＜ 0.05），见图2A、2B。qRT-PCR结果显示，与对照组比较，siRNA干扰组Dnmt3b的表达显著下降（P＜ 0.05），抑制达75%以上，见图2C；细胞计数可见Mock组和NC组细胞生长速度相近，而与Mock组和NC组比较，siRNA干扰组细胞生长受到抑制（P＜ 0.05），见图2D。说明siRNA转染后显著下调Dnmt3b的表达。

2.3 5-Aza-CdR处理、Dnmt3b siRNA干扰后癌基因和抑癌基因mRNA的表达

与对照组比较，经5 μmol/mL 5-Aza-CdR处理后WWOX、MMP7表达显著下调，TCF21、TIMP1表达显著上调，差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表3。与NC组比较，siRNA干扰组抑癌基因BRCA1、BRCA2及癌基因MMP7、survivin的表达均显著下调（均P＜0.05），见表3。

2.4 高通量测序检测5-Aza-CdR处理后miRNA的表达情况

高通量测序结果显示，1 319个miRNA表达存在差异，其中，67个miRNA表达有统计学差异（均P＜0.05），见图3。20个miRNA实验组与对照组均有表达，见表4；47个miRNA对照组中无表达，见表5。

图1 5-Aza-CdR处理后细胞DNA甲基化水平的改变×400Fig.1 Changes in DNA methylation levels in cells after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment×400

图2 siRNA干扰后细胞生长及Dnmt3b的表达Fig.2 Cell growth and DNMT3b expression after siRNA interference

2.5 qRT-PCR检测5-Aza-CdR处理、Dnmt3b siRNA干扰后miRNA的表达情况

与对照组比较，经5 μmol/mL 5-Aza-Cdr处理后miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表达量显著上调（P＜0.05），并且此8个miRNA的差异性表达与高通量测序结果一致。与NC组比较，siRNA干扰组中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表达显著上调，而miR-200b、miR-127的表达显著下调（均P＜ 0.05），见表6。

3 讨论

miRNA来源于细胞核内基因组的miRNA基因，部分miRNA位于CpG岛附近或位于CpG岛中，这些miRNA表达极易受到DNA异常甲基化的调控［7-9］。miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，尽管完整的miRNA表达调控机制目前尚不清楚，但已有研究提示肿瘤细胞中DNA甲基化异常会引起miRNA表达改变。HASHIMOTO等［10］研究显示胃癌组织和细胞中miR-181c基因CpG岛高甲基化，而miR-181c低表达，经5-Aza-CdR处理后miR-181c表达恢复，同时抑制了胃癌细胞增殖。在DNA甲基化过程中，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）参与催化，其包含Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b等，其中Dnmt3b参与CpG从头甲基化［11］。有研究［7］表明乳腺癌组织中Dnmt3b表达增加，并且与肿瘤分期及预后相关。本研究通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平，结果显示，miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520、miR-654的表达显著上调，而仅干扰Dnmt3b表达时，miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-502a、miR-654表达显著上调，miR-127、miR-200b表达显著下调，此结果与高通量测序结果基本一致。有研究［13-14］表明miR-29家族可调控Dnmt3a和Dnmt3b的表达。由此可见，Dnmt3b会受到miRNA的调控，也可以改变部分miRNA基因甲基化状态，从而影响它们的转录表达。

表3 5-Aza-CdR处理及Dnmt3b siRNA干扰后癌基因和抑癌基因mRNA的表达Tab.3 Relative mRNA expression of oncogenes and tumor suppressors after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

图3 5-Aza-CdR处理后MCF-7 miRNA高通量测序差异表达Fig.3 Identification of differentially expressed miRNAs after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-cdR）treatment

表4 高通量测序中miRNA差异表达Tab.4 Differential expression of miRNAs determined via high-throughput sequencing

表5 高通量测序中对照组不表达的miRNATab.5 List of miRNAs not expressed in the control group as determined via high-throughput sequencing

表6 5-Aza-CdR处理及Dnmt3b siRNA干扰后miRNA的表达Tab.6 Relative expression levels of miRNA after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

乳腺癌的发生发展与癌基因的表达增高和抑癌基因的沉默密切相关，Dnmt3b作为甲基化的催化剂可以影响部分基因表达的功能。已有研究表明，在癌组织中抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2［15-20］表达下降，而癌基因MMP7［21］、TIMP1［22］、PKM2［23］、survivin［24］表达增高。本研究中5-Aza-CdR可以使乳腺癌细胞中抑癌基因WWOX和癌基因MMP7表达降低，而上调抑癌基因TCF21和癌基因TIMP1，其中TCF21和MMP7的表达符合预期结果，而WWOX和TIMP1的结果分析原因可能是由于转录后调控影响这些基因的表达。对于siRNA干扰抑制Dnmt3b的表达中可见癌基因TIMP1、PKM2、survivin的表达显著降低，而抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表达也降低，分析原因可能是由于甲基化程度与组织特异性的关系存在多样化，虽然这些基因在前列腺癌、肺癌、大肠癌甚至乳腺癌中甲基化程度较高，但实验中所培养的细胞种类不同、肿瘤的分期进展不同、肿瘤的组织种类不同，其甲基化水平也不相同。另外本研究仅对Dnmt3b进行干扰抑制Dnmt3b的表达，推测Dnmt3b对WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表达影响较小，并不占主要调控位置，其他甲基转移酶是这些基因发生甲基化的主要因素，目前研究者对乳腺癌易感基因的甲基化研究还不够成熟，往往出现矛盾的结果，具体原因还有待进一步探讨。

综上所述，Dnmt3b可影响乳腺癌细胞相关基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2、MMP7、TIMP1、PKM2、survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a的表达。DNA甲基化是一种可逆的表观遗传学修饰方式，逆转与肿瘤发生发展相关的miRNA基因甲基化水平将改变肿瘤细胞的生物学特性，为肿瘤的精准治疗提供新的方向［25］。本实验从Dnmt3b对miRNA及mRNA的影响作用出发，应用siRNA干扰的方法改变Dnmt3b的表达，检测乳腺癌相关miRNA及mRNA的表达情况，明确了Dnmt3b对miRNA及靶基因mRNA的相互调控机制，为乳腺癌的临床精确诊治提供了依据。