沙蟾毒精酯类衍生物的合成和抗肿瘤活性研究

罗 川，马建江，缪震元，吴岳林 （. 安徽华润金蟾药业股份有限公司，安徽 淮北 5000；. 上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海 048；. 海军军医大学药学院，上海 004）

活性天然产物是药物研发重要的先导化合物来源之一，基于天然产物已成功开发出很多临床治疗药物。从我国传统中药中分离有效活性成分，已成为国内外发现先导化合物的一个有效途径。蟾蜍是我国特有中药材，具有解毒、消肿、止痛、强心利尿、抗癌等作用[1-3]。现代研究发现中药蟾蜍含有多种抗肿瘤活性成分，其中，主要化学成分之一的沙蟾毒精（图1）具有优秀的体内外抗肿瘤活性，但其心脏毒性使得沙蟾毒精治疗窗窄，无法作为抗肿瘤药物进行后续开发[4-7]。早期研究表明，沙蟾毒精的3 位羟基对活性和毒性有较大影响[8]。Deng等对沙蟾毒精的3 位进行了修饰，设计了一类成纤维细胞活化蛋白-α 靶向沙蟾毒精前药衍生物，不仅在体内外显示出优异的抗肿瘤活性，而且降低了心脏毒性[9]。果德安等也对沙蟾毒精的3 位羟基进行了结构修饰，设计得到一类3-氮取代氨基甲酸酯类衍生物，对A549、HCT116、Calu-6、PANC-1、SW620和NSCLC 等6 种细胞株均显示出优秀的活性，其IC50值在10 nmol/L 以下[10]。因此，笔者设计3 位酯基取代的沙蟾毒精衍生物，进一步探讨沙蟾毒精的构效关系，从中筛选获得高活性的候选化合物。

1 仪器与试剂

核磁共振仪为Bruker 300 或600 型，TMS 为内标，CD3OD、DMSO-d6 或者CDCl3为溶剂。化学位移（δ）和偶合常数（J）分别以×10-6（ppm）和Hz 为单位。在API-3000LC-MS 型质谱仪上完成ESI 质谱。TLC 分析所用硅胶板为GF254（青岛海洋化工有限公司）。硅胶柱层析采用60G 硅胶（青岛海洋化工有限公司）。商品化溶剂皆为市售分析纯或化学纯。

2 实验方法

2.1 化合物2a-2j 的合成方法

图1 沙蟾毒精及其代表性衍生物的化学结构

将沙蟾毒精（83 mg, 0.2 mmol）、酸（0.3 mmol）、DMAP（24.4 mg, 0.2 mmol）和5 ml 干燥的二氯甲烷加入到25 ml 烧瓶中，氩气保护下逐份加入EDCI（115 mg, 0.6 mmol）。室温反应过夜，反应完全后蒸去溶剂，残余物经柱色谱纯化后得目标产物2a-2j (洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇=100∶1)。

2a: 白色固体，收率13.9%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.68 (d, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.28 (d,1H),5.43 (s,1H), 5.18 (d,1H), 4.14 (d, 1H), 4.05 (d, 2H),3.91 (q, 1H), 2.15 (d, 2H), 2.02～2.11 (m, 1H), 1.86(m, 9H), 1.40 (s, 4H), 1.26 (d, 2H), 1.14 (s, 3H), 0.97(s, 3H)。

2b: 白色固体，收率为55.5%。1H NMR: (CDCl3,500 MHz) δ: 7.76 (d, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.27 (d, 1H),5.30 (s, 1H), 4.33 (d,1H), 4.11 (d,1H), 3.84 (s, 1H),2.43 (d, 1H), 2.30 (t, 2H), 2.05～2.09 (m, 2H),1.86～1.94 (m, 2H), 1.75～1.80 (m, 5H), 1.63～1.73(m, 4H), 1.45 (d,1H), 1.33～1.44 (m,15H), 1.27 (s,3H), 0.86～0.88 (m, 3H)。

2c: 白色固体，收率15.2%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.74 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 6.30 (d, 1H),5.08 (s, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.84 (d, 1H),2.45 (d, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.65～1.92 (m, 11H),1.46～1.53 (m, 1H), 1.26～1.42 (m, 5H), 1.21 (s,3H), 0.92 (s, 3H)。

2d: 白色固体，收率46.7%。1H NMR: (CDCl3,500MHz) δ: 8.85 (s, 1H), 8.40 (m, 2H), 7.62～7.77(m, 2H), 7.41 (s, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.38 (s, 1H), 4.36(m, 1H), 4.13 (d, 1H), 3.86 (d, 1H), 2.56 (d, 1H),1.72～2.24 (m, 11 H), 1.32～1.51 (m, 6H), 1.23(s,3 H), 0.94 (s, 3H)。

2e: 白色固体，收率43.5%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.66～7.74 (m, 1H), 7.37 (d, 1H), 7.08～7.20 (m, 3H), 6.27 (t,1H), 5.30 (s, 1H), 4.36～4.26(m, 1H), 4.00～4.15 (m, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.56 (d,1H), 2.27～2.41 (m, 3H), 2.04 (m, 2H), 1.80～1.86(m, 3H), 1.70～1.79 (m, 4H), 1.64 (s, 3H), 1.26～1.42 (m, 6H), 1.18 (s, 1H), 1.13 (s, 1H), 1.01 (d, 1H),0.91 (d, 3H)。

2f: 白色固体，收率50.3%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.94 (d, 1H), 7.72 (d, 1H), 7.53 (d, 1H),7.40 (s, 1H), 7.32 (d, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.36 (s, 1H),5.30 (s, 1H), 4.35 (t, 1H), 4.06～4.16 (m, 1H), 3.85(d, 1H), 2.51 (d, 1H), 1.97～2.13 (m, 3H), 1.74～1.89(m, 8H), 1.45～1.54 (m, 1H), 1.31～1.45 (m, 3H),1.25 (s, 1H), 1.21 (s, 3H), 0.93 (s, 3H)。

2g: 白色固体，收率42.6%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 10.11 (s, 1H), 8.20 (d, 2H), 7.97 (d, 2H),7.72 (d, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.37 (s, 1H),5.30 (s, 1H), 4.36 (m, 1H), 4.12 (t, 1H), 3.81～3.93(m, 1H), 2.55 (d, 1H), 2.08 (t, 2H), 1.84～2.00 (m,4H), 1.76～1.84 (m, 5H), 1.61 (s, 3H), 1.38 (d, 3H),1.25 (s, 3H), 0.93 (s, 3H)。

2h: 白色固体，收率12.5%。1H NMR: (CDCl3,500MHz) δ: 7.73 (m, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.27 (d, 1H),5.23 (s, 1H), 4.35(q, 2H), 4.36～4.40 (m, 1H), 4.04～4.14 (m, 1H), 2.46 (d, 1H), 1.69～2.26(m, 10H), 1.57(d, 1H), 1.22～1.50 (m, 8H), 1.20 (s, 3H), 0.91 (s,3H)。

2i: 白色固体，收率52.3%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.74 (m, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.42 (s, 1H),6.79 (s, 2H), 6.38 (d, 1H), 6.32 (d, 1H), 5.32 (s, 1H),5.23 (s, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.08～4.19 (m, 1H), (3.92(d, 9H), δ3.87 (d, 1H), 2.51 (d, 1H), 1.84 (m,, 10H),1.40 (t, 3H), 1.28 (s, 3H), 1.25 (s, 3H), 0.95 (s, 3H)。

2j: 白色固体，收率39.2%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.84 (d, 1H), 7.74 (m, 1H), 7.50 (t, 1H),7.42 (s, 1H), 7.02 (t, 2H), 6.32 (d, 1H), 5.35 (s, 1H),4.37 (m, 1H), 4.18～4.09 (m, 1H), 3.92 (d, 3H), 3.87(d, 1H), 2.52 (d,, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.78～2.00 (m,7H), 1.59 (s, 3H), 1.28～1.46 (m, 6H), 1.25 (s, 3H),0.96 (s, 3H)。

2.2 体外抗肿瘤活性测试

选用人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Bel7404 和人肠癌细胞HCT116，均由海军军医大学药学院冻存和传代。在37 ℃、5 % CO2条件下，用含有10 %的胎牛血清、1 %的青霉素和链霉素的DMEM 培养基中传代培养细胞。弃去培养皿中的上层培养基，用PBS 洗细胞2 次，再加入胰酶，放入培养基中消化1～2 min，待细胞脱壁后，再加入新的培养基，轻轻吹打，使细胞完全脱落，待细胞入5 ml 新的培养基，轻轻吹打，用细胞计数法计算细胞浓度，然后接种于96 孔板中。将接种完的96 孔板放置于37 ℃、5 %的CO2培养箱中孵育过夜，次日细胞即可贴壁。按照不同的实验设计加入不同浓度的药物，每组设3～4 个复孔，每孔加入10 μl 相应浓度的药物，再将96 孔板放入培养箱继续 培 养。活 性 测 试 采 用10 % CellTiterTMBlue（Promega, Cat.# G8081/2, US）试剂盒，并在37 ℃、5 % CO2环境下孵育1 h。用酶标仪（Bio Tek, US）测量530/40 nm 和590/35 nm 处荧光值，计算公式：

细胞存活率 (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。

图2 3-沙蟾毒精酯类衍生物2a-2j 的合成路线

其中，As: 实验组（含有细胞、荧光试剂和化合物的培养基）；Ac: 对照组（含有细胞和荧光试剂，不含化合物的培养基）；Ab: 空白组（不含细胞、化合物的培养基）。

3 结果与讨论

3.1 化学合成

目标化合物通过各类酸和沙蟾毒精发生酯化反应得到，收率为12.5%～55.5%，合成路线见图2。从反应收率上看，芳香族酯类衍生物收率高于脂肪族类酯类衍生物。例如，化合物2c 为乙酸酯衍生物，收率仅为15.2%，而化合物2e 为对甲基苄酯衍生物，收率为43.5%。在反应中还发现，水分对反应有较大影响。因此，反应溶剂需要干燥处理，并且反应体系还需保持在无水条件下，才能保证反应顺利进行。

3.2 体外抗肿瘤活性研究

课题组选择3 种肿瘤细胞株(MCF-7、Bel7404和HCT116)，以沙蟾毒精为阳性对照，采用CellTiter法开展了体外抗肿瘤活性研究，结果见表1。可以看出，3-沙蟾毒精酯类衍生物均具有优异的体外抗肿瘤活性。对MCF-7 细胞株，化合物2a、2c 和2j 显示出高于阳性对照药沙蟾毒精的活性。对Bel7404 细胞株，所有化合物均显示出优异的活性，其中，化合物2a、2b、2d 和2e 活性最好，其IC50值均在数个纳摩尔，相比沙蟾毒精提高近1000 倍。对HCT116 细胞株，化合物2e 活性最高，其IC50值为4.5 nmol/L，相比沙蟾毒精提高了3.7 倍，化合物2b 和2c 与阳性药相当。

表1 沙蟾毒精及其酯类衍生物2a-2j 的体外抗增殖活性(μmol/L)

整体而言，脂肪族酯类化合物活性高于芳香族酯类化合物，例如对MCF-7 细胞株，溴乙酸酯衍生物2a 的IC50值为91.7 nmol/L，而芳香族酯类化合物除2j 外，活性均在100 nmol/L 以上。

4 结论

基于活性天然产物沙蟾毒精骨架，在其3 位引入酯基基团，设计合成出10 个3-沙蟾毒精酯类衍生物。体外抗肿瘤活性研究发现，所有的化合物对3 种肿瘤细胞株MCF-7、Bel7404 和HCT116 均显示出优异的抗肿瘤活性。其中，化合物2a 活性最好，对3 种肿瘤细胞株的IC50值均在100 nmol/L以下，可作为抗肿瘤候选化合物进行进一步研究。