筋骨宁膏中黄曲霉毒素的测定

倪倩，南文萍，张俐*（. 江苏省食品药品监督检验研究院，南京 009；. 南京中医药大学，南京 003）

筋骨宁膏由骨碎补、凤仙透骨草、五加皮、生天南星、续断、蒲公英、当归、羌活、红花、土鳖虫、桃仁、乳香、没药、樟脑、冰片、桉叶油、水杨酸甲酯、盐酸苯海拉明组成。其功效为活血化瘀、消肿止痛、舒筋活络，主要用于闭合性骨折和跌打损伤。

其药味之一土鳖虫别名䗪虫、地鳖和土鳖，为鳖蠊科（Corydiidae）昆虫地鳖Eupolyphaga sinensisWalker. 或冀地鳖Steleophagaplancyi（Boleny）的雌虫干燥体。其性寒，味咸，有破淤血、续筋骨的功效，是跌打损伤、消肿止痛和活血化瘀中成药的常用组成成分。土鳖虫在采收、加工、运输及储存环节中，极易发生霉变并产生黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）。黄曲霉毒素是一种强致癌的霉菌毒素，最常见的是黄曲霉G1（Aflatoxin G1，AFG1）、G2（Aflatoxin G2，AFG2）、B1（Aflatoxin B1，AFB1）、B2（AflatoxinB2，AFB2）。 其 中AFB1的毒性最大，分布最广，属于Ⅰ类致癌物。近年来，陆续有文献报道土鳖虫中黄曲霉毒素超标的现象[1-2]。有研究表明，AFB1 对人皮肤成纤维细胞具有明显的细胞毒性作用[3]，说明对外用制剂控制黄曲霉毒素也很有必要。《中国药典》2020年版一部对土鳖虫中黄曲霉毒素规定了限度，AFB1 限度为5 μg·kg－1，AFB1、AFB2、AFG1 与AFG2 的总量限度为10 μg·kg－1[4]，但未对土鳖虫相关制剂黄曲霉毒素进行控制，相关检测方法并不完善。

本文利用黄曲霉毒素的溶解性（易溶于油、三氯甲烷、甲醇和乙腈，不溶于水、乙醚和正己烷），对可能存在污染的贴膏剂制品建立了新的提取方式，为黄曲霉毒素的检测与监管提供新思路。

1 仪器与试药

ExionLC 型超高效液相色谱、AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美国SCIEX 公司）；CPA0045 型万分之一电子分析天平（德国Sartorius 公司）；TG16-WS 离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水处理系统。色谱柱PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）。甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水；免疫亲和色谱柱（北京华安麦科生物技术有限公司）。黄曲霉毒素混合对照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 标示质量浓度分别为1.04、0.38、1.08、0.38 μg·mL－1，批号：610001-202006，中国食品药品检定研究院）。筋骨宁膏（土鳖虫处方量占处方生药总量6.7%，江苏百益制药有限公司，批号分别为200601-1、210201）。

2 方法与结果

2.1 液相-质谱条件

色谱柱：PhenomenxTitank C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相以10 mmol·L－1醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；柱温25℃；流速0.3 mL·min－1；按表1 程序进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子检测方式；多反应检测（MRM 模式）；气帘气：35 psi；离子源温度：550℃；电喷雾电压：5500 V；雾化器：55 MPa；辅助器：60 MPa；各化合物监测离子对和碰撞电压（CE）见表2。

表2 监测离子对和碰撞电压Tab 2 Monitoring ion pair and collision voltage

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液500 μL，置50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即为线性1 号溶液。精密量取线性1 号溶液5、4、3、2 和1 mL，分别置25、25、25、25 和50 mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液2、3、4、5和6号溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取本品1 g，置50 mL离心管中，加入10 mL 正己烷浸渍1 h，涡旋3 min，即可将背衬层表面的膏状层完全溶解，呈乳液状。再精密加入10 mL70%甲醇，涡旋3 min后，9000 r·min－1离心5 min，此时膏状层和背衬层在瓶底聚集，溶液分为澄清的上下两层，黄曲霉毒素溶解于下层的70%甲醇中，精密量取下层液体6 mL，置20 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，9000 r·min－1离心5 min，取全部上清液，通过免疫亲和柱，流速3 mL·min－1，用水20 mL 洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过（0.22 μm），取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取空白溶剂（甲醇）与线性2 号溶液各5 μL，分别注入超高效液相色谱-质谱仪，考察各组分峰形（见图1）。结果各成分峰形较好，响应值高，空白溶剂中未提取出离子峰，说明对检测无干扰，所选择的监测离子对较为合适。

图1 空白溶剂和对照品溶液的提取离子峰图Fig 1 Extracted ion chromatogram of blank solvent and reference solution

2.4 线性关系考察

取“2.2”项下系列线性溶液，精密量取5 μL，注入超高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表3。

表3 线性关系与范围Tab 3 Linear relation and range

2.5 精密度试验

精密量取线性2 号溶液5 μL，连续进样6 次，以峰面积计算RSD，考察精密度。结果AFG2 峰面积RSD为0.75%，AFG1 为1.6%，AFB2 为1.6%，AFB1 为1.8%，表明本法精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取本品1 g，按“2.2.2”项下方法操作，平行制备6 份，结果6 份样品中均未检出黄曲霉毒素。

2.7 检测限与定量限

取线性6 号溶液逐级稀释至S/N约为3，即为检测限，S/N约为10，即为定量限。结果表明，本法灵敏度较高，符合检测要求（见表4）。

表4 检测限与定量限结果Tab 4 LOD and LOQ

2.8 加样回收试验

精密称取本品1 g，精密加入线性1 号溶液350 μL，按“2.2”项下方法操作，平行制备6 份，进样测定，结果加样回收率见表5。结果表明，各成分回收率在72.80%～86.40%，RSD均小于10%，说明本法可有效提取出制剂样品中的黄曲霉毒素。

表5 加样回收试验结果Tab 5 Recovery

2.9 样品测定结果

精密量取“2.2.2”项下供试品溶液5 μL，进样测定，结果表明，2 批样品中均未检出黄曲霉毒素。

3 讨论

3.1 提取方法的确立

黄曲霉毒素的提取多采用甲醇-水或乙腈-水的提取方式，但是贴膏剂中具有活性物质的膏状层不溶于甲醇-水或乙腈-水体系，导致包裹在其中的成分难以被提取出。本文中的提取方法将膏状层完全溶解在正己烷中，再用甲醇-水进行提取，大大提高了黄曲霉毒素的提取回收率。

另外，比较了乙腈-水与甲醇-水的提取效率，结果表明，乙腈-水与甲醇-水的提取回收率几乎无差别，但乙腈-水提取液颜色偏深，说明干扰物多于甲醇-水体系，因此最终选择甲醇-水作为提取溶剂。

3.2 分析方法的确立

本文参考2020年版《中国药典》四部通则2351 真菌毒素测定法，对质谱条件进行了人工优化，使得4 个黄曲霉毒素的检测灵敏度更高。

3.3 存在的不足

本文虽然为土鳖虫相关贴膏剂类产品黄曲霉毒素的测定与监管提供了新方法与新思路，但依然存在不足，由于样本量较少，不能全面评估该类产品的质量。鉴于土鳖虫相关产品黄曲霉毒素污染情况较为严重，并且黄曲霉毒素对表皮细胞存在一定毒性，透皮吸收情况也尚不明确，因此应该加大对此类产品的质量监控，获取足量数据后再对此类产品的质量监管采取合理措施。