天津地区野生山樱桃花部结构及生殖特征研究

杨 楠,聂江力,石福臣,杨丽芳

(1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.南开大学生命科学学院，天津 300071；3.天津市果树研究所，天津 300112)

山樱桃(Cerasusserrulate)是蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)多年生落叶乔木，广泛分布于黑龙江、河北、山东、江苏、浙江、安徽、湖南、贵州等省海拔500～1 500 m的山谷林中[1]。山樱桃开花时气味芳香，花朵繁密，对绿化美化环境、净化空气、改善生态系统、防止水土流失、调节小气候等具有很好的效果，花和果实可食用，也可作为樱花、樱桃嫁接的砧木[2]；具有极高的观赏价值，更重要的是野生山樱桃蕴含着樱花种质珍贵的基因库，是樱花品种改良和繁育的重要资源，同时，也可为天津本地樱桃水果的品质改良提供珍贵的亲本材料。

植物的交配系统与其繁育器官和生殖特性有着密不可分的关系，自然界中的植物通常会采用异交的繁殖方式来增加遗传多样性，以防止发生“近交衰退”，以增强其后代的环境适应力[3-4]。花作为植物的繁殖器官，其外部形态特征及内部器官发育能影响植物的传粉方式和交配模式[5-6]。传粉是植物有性生殖过程的基础，以大量花粉、传粉媒介和可授的柱头为基础[7]。作为有性生殖过程的基础，传粉具有十分重要的意义，花部特征，花粉活力及柱头可授性等特征对传粉成功率有极大的影响[8]。因此，在野外调查过程中，对花部特征、花粉活力和柱头可授性的测定十分必要。2018年在天津蓟州区八仙山自然保护区中发现野生山樱桃，其中有一株树龄达百年，高约20 m，周围零散分布十几株山樱桃小树。本试验于2019年1月以该处野生山樱桃为实验材料，对其花部特征、花粉活力、柱头可授性及生殖特征进行研究，以期为天津地区樱属植物的有性繁殖特征，以及进一步研究开发山樱桃的繁育和樱桃水果改良等技术问题积累资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料与研究地概况

山樱桃(Cerasusserrulate)采集地位于天津市蓟州区八仙山自然保护区内，保护区内属暖温带季风性大陆气候，气候温湿，夏季多雨，年平均降雨量约9 568 mm，年平均气温8～10 ℃，7月份平均气温23.4 ℃，海拔1 000 m左右。

3月初将带有花芽的枝条带回实验室(室温15～25 ℃)水培，从幼小花蕾期开始采集，将花蕾置于室温下干燥放置12 h，待花药开裂散粉后，将花粉连同花药壳一起放置于室温、-4 ℃和-20 ℃下保存待用。

1.2 花部综合特征观察

花朵开放前，每天观察植株的生长情况，开花当天和第2天全天观察，每2 h观察1次。从开花第3天起每日固定观察1次，直到花朵枯萎凋落。观察花朵的花被片开展、花药散粉、柱头分泌粘液及伸长和弯曲、是否有气味及其花瓣展开和开放持续时间、花朵萎蔫过程及时间等情况。

1.3 花粉活力测定

1.3.1花粉离体培养的适宜蔗糖浓度和观测时间

筛选适宜的蔗糖浓度测定山樱桃花粉活力，设置5种蔗糖浓度处理，分别为0、5、10、15、20 g·L-1，其他培养基成分为：MS培养基+0.5%琼脂+0.5 g·L-1硼酸，pH=7。取自然散粉的新鲜花粉于25 ℃下培养6 h后观察并统计花粉萌发率。

选用最适蔗糖浓度配制的培养基，取新鲜花粉于25 ℃培养箱中进行培养，分别在培养1、2、4、6、8、16、24 h时观察并统计当前的花粉萌发率和花粉管长度。

1.3.2花粉生活力测定方法比较

I2-KI染色法：加1～2滴I2-KI染液于单凹载玻片凹槽内，将适量花粉置于染液中，培养5 min后观察，染成蓝黑色为有活力的花粉，黄褐色或无色则为发育不良或无活力的花粉。

醋酸洋红染色法：加1～2滴醋酸洋红染液于单凹载玻片凹槽内，将适量花粉置于染液中，培养5 min后观察，染成红色为有活力的花粉，没有颜色或颜色较淡则为发育不良或无活力的花粉。

1.3.3不同花药开裂时间的花粉活力

标记同一开放时期的山樱桃花蕾，采集花药开裂后不同时间的花粉进行培养，培养基比例和培养时间均参考1.2.1的试验结果。

1.3.4不同贮藏温度对花粉活力的影响

盛花期取饱满花药，分别保存于常温、-4 ℃和-20 ℃下，在第1、3、6、9、18、36、72、120天时取出贮藏花药中的花粉，选择最适浓度的培养基和最佳观察时间进行培养，观察并统计花粉萌发率。

1.4 柱头可授性测定

采集不同开放阶段的花朵，每个时期采集5个柱头，在载玻片中加入联苯胺-过氧化氢反应液(V1%联苯胺∶V3%过氧化氢∶V水=4∶11∶22 )，将柱头浸入其中，观察柱头周围是否呈现蓝色并产生大量气泡，并可根据反应的剧烈程度判断柱头的可授性强弱。

1.5 花粉-胚珠比(pollen-ovule ratio,P/O)的检测

摘取10个花药未开裂的花蕾，取下全部花药，浸入1 mL 8.0 mol·L-1NaOH溶液中，用解剖针将花药捣碎，使花粉散出，并定容至2 mL，充分震荡制成花粉悬浮液，用血球计数板计数，计算单个花蕾的花粉粒总数的平均值。取花蕾的子房进行解剖，记录胚珠数。

1.6 杂交指数(Outcrossing index,OCI)的估算

用游标卡尺测定山樱桃花冠直径，记录花药开裂和散粉的时间，柱头具可授性的时间，以及花药与柱头间的空间距离，参照Dafhi[9]的标准计算野生山樱桃的杂交指数。

1.7 数据分析

采用Excel和SPSS 22.0软件对试验数据进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 花部综合特征

由图1可见，野生山樱桃具有樱属植物的花器官特征，每个花芽可形成1朵或2朵以上花，花瓣白色，部分尖端带淡粉色，花冠直径在1.42～1.92 cm范围内，花瓣5片，形状为倒卵形，先端有凹缺，花瓣长0.83～1.18 cm，宽0.62～0.92 cm。雌雄同株，雄蕊多数为23～33枚，长度为0.89～1.02 cm。雌蕊1枚，长度多为1.12～1.31 cm，花药黄色，着生方式为丁字着药雌蕊明显高于雄蕊，为完全花。花萼绿色，萼筒漏斗状，花梗长 1.58～2.13 cm，萼片、萼筒及花梗被有白色绒毛。

野生山樱桃单花开放持续时间为3～4 d，过程可分为花萼开裂、花瓣绽开、雄蕊露出、花药开裂授粉、雄蕊和柱头萎蔫、花瓣凋谢6个阶段。在山樱桃花蕾期，花苞为绿色，顶部中央为白色或淡粉色。开花当天，花瓣开始松动使花萼开裂，雄蕊先于雌蕊露出，刚刚开放时花柱低于雄蕊，柱头为三瓣开裂，花朵完全开放后花柱高于雄蕊。花药完全暴露在外界2 h后基本开裂散粉，开花2 d后花粉完全散出，第3天雄蕊和雌蕊逐渐枯萎变成褐色，并开始脱落，直至整花全部枯萎，完成整个开花过程。

2.2 花粉活力测定

2.2.1花粉离体培养的适宜蔗糖浓度和观测时间

选用不同蔗糖浓度(0，5，10，15，20 g·L-1)培养基进行花粉萌发最适蔗糖浓度研究，培养6 h时统计花粉萌发率。由图2可知，培养基中其他成分含量不变，花粉生活力随蔗糖浓度增加逐渐增强，不含蔗糖的培养基中花粉活力仅为7.6%，当蔗糖浓度增加为15 g·L-1时，花粉萌发率达47.8%，显著高于蔗糖浓度为0和5 g·L-1的培养基中的花粉活力。当蔗糖浓度增加至20 g·L-1时，花粉萌发率降低至32.6%。

将山樱桃花粉置于蔗糖浓度为15 g·L-1的培养基中进行培养，定时测定当前的花粉萌发率和花粉管长度。试验过程中，随着培养时间的增加，山樱桃花粉管萌发后会出现断裂和解离的现象，所以前期已萌发或破裂的花粉细胞，不计入当时的花粉萌发数[10]。由图3可知，随着培养时间的增加，花粉即时萌发率呈先增加后降低的趋势，并在6 h时达到最高，为49.6%。当培养时间延长至24 h时，花粉即时萌发率降低至5.2%，仅有极少数花粉萌发。花粉管长度变化趋势与花粉即时萌发率变化趋势接近，培养4 h和6 h时即时花粉管长度均显著高于其他时段，培养6 h时即时花粉管长度达到最大值，为262.7 μm。培养时间超过16 h后，花粉管长度变化较为平缓。

2.2.2花粉生活力测定方法比较

本试验选用I2-KI和醋酸洋红分别对山樱桃花粉进行染色，另取花粉用蔗糖浓度15 g·L-1的培养基培养6 h，分别测定花粉生活力。由图4可知，I2-KI和醋酸洋红对花粉的染色程度较高，平均花粉生活力分别为73.1%和78.3%，显著高于最适培养基中花粉的萌发率。

2.2.3花药开裂不同时间的花粉活力

本试验于山樱桃花药裂开后不同时间采集花粉，用蔗糖浓度为15 g·L-1的培养基培养6 h后测定花粉萌发率。由图5可知，花药刚散粉时，花粉萌发率较低，仅为4.7%。随着散粉时间延长，花粉萌发率逐渐增加，于散粉3 h时达到最大萌发率(53.2%)。散粉6 h后，花粉活力开始显著下降，12 h时已低至7.2%。

2.2.4不同贮藏温度对花粉活力的影响

不同贮藏时间对山樱桃花粉活力影响显著，山樱桃花粉于最适培养基中培养的萌发率可达53.2%。由图6可知，相同贮藏时间内，贮藏温度越低，花粉生活力越强。-4 ℃和-20 ℃下贮藏3 d内，山樱桃花粉萌发率均高于40%。同时，花粉萌发率随贮藏时间的延长逐渐降低，山樱桃花粉于25 ℃下保存1 d，萌发率已经降低至7.8%，保存9 d后则基本失去生活力。花粉于-4 ℃下保存36 d后，萌发率已降低至1.5%，72 d时已完全失去活力。而-20 ℃下花粉萌发率在保存72 d时降低至3.7%，并在120 d时完全失去活力。

2.3 花蕾开放不同时间的柱头可授性

由表1可知，在花蕾期，即花朵尚未完全开放时，已有部分柱头具有一定的可授性。此时，柱头为浅绿色，表面有分泌物，高度低于雄蕊。从花朵开始开放，柱头逐渐增长，高于雄蕊，随着花朵展开，柱头颜色加深，柱头可授性逐渐增强。在盛花期，花朵展开至最大时，柱头可授性最强，且柱头显著高于雄蕊。末花期时，柱头逐渐变为浅褐色，分泌物减少，可授性随之降低。最终进入落花期，干枯褐变，失去可授性。

表1 野生山樱桃不同开放时间柱头可授性Table 1 Stigma receptivity analysis of wild C.serrulate at different flowering times

2.4 花粉-胚珠比

野生山樱桃单朵花花粉数和胚珠数比值为47 284±4 587，参照Cruden[11]的标准，野生山樱桃的繁育系统类型属于专性异交。

2.5 杂交指数的估算

按照Dafhi[9]的标准对野生山樱桃的杂交指数进行估算。野生山樱桃花冠直径1.42～1.92 cm，记为3，花药开裂散粉时间与柱头具可授性时间基本重合，记为0，从花朵开放至枯萎，柱头始终高于花药，记为1，计算得出杂交指数为4，野生山樱桃的繁育系统以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者，属于兼性异交。

3 讨 论

花性状主要包括花的颜色、大小、形状、花粉数量和花粉胚珠比等，这些性状受植物营养状况，传粉机制和外界环境条件影响[12]。野生山樱桃单花花期3～4 d，同一植株上花朵开放不同步，延长了植株的花期，有效增加了昆虫访花行为和传粉受精的成功率。野生山樱桃开花后，花药散粉时柱头已经具有可授性，且在花粉活力较高时，柱头可授性也较强，但自花朵开放，柱头始终高于花药，这可能是导致野生山樱桃自然授粉结实率较低的原因。

在野生山樱桃花粉活力的测定中，I2-KI染色、醋酸洋红染色和离体萌发法均能测定山樱桃的花粉活力。其中，I2-KI染色法和醋酸洋红染色法虽简便快捷，但受花粉壁厚度等因素影响，导致颜色区分不明显，试验结果显著高于离体培养法的试验结果，并不适合山樱桃花粉活力的测定，这与李庆宏等[13]的研究结果一致。

在离体培养过程中，本试验发现野生山樱桃花粉离体培养的最适蔗糖浓度为15 g·L-1，最适观察时间为培养6 h时，此时花粉生活力和花粉管长度均达到最大值。山樱桃花粉开花12 h内均保持较强生活力，其中3 h时花粉生活力最高。不同植物，不同品种以及外界环境条件均会对花粉萌发率产生影响。选择花粉活力最高的生长时期获取花粉，能够提高杂交育种的成功率。

花粉贮藏试验以花药形态贮存的花粉为材料进行，相较于花粉直接保存，保持花药形态具有更好的耐贮存性，这可能是因为花药壁周围含水量较高[14]。试验结果表明，野生山樱桃花粉对贮藏温度较为敏感，25 ℃下保存9 d时花粉已经失去活力，而在-20 ℃下保存72 d时依然保持活力。贮藏温度越低，花粉呼吸强度和酶活性也随之降低[15]，则越有利于花粉活力的保存。Sulusoglu M[16]研究发现，-20 ℃下保存730 d的甜樱桃栽培品种 0900 Ziraat 和 Prime Giant 花粉萌发率分别为 21.54%和 33.50%。果树花粉冷冻保存被认为是所有贮存模式中较为有利的一种[17]。

柱头可授性的强弱变化会影响植物的授粉结实[18]，它受植物单花期长短，柱头分泌物，开花时间等因素影响[19]。柱头在开放期间产生分泌物，能够增加花粉在柱头上停留的几率，并为花粉的萌发提供条件[20]。试验观察了野生山樱桃花朵展开的过程中柱头的变化，并采用联苯胺-过氧化氢法测定不同时期的柱头可授性。结果表明，野生山樱桃柱头在未完全开放时即具有一定可授性,且随花朵展开，其柱头可授性也逐渐增强，并于盛花期达到最强，此时进行人工授粉，则会在一定程度上提高授粉成功率。

花粉/胚珠比和杂交指数在植物繁育系统的研究中应用十分广泛[21-22]。花粉/胚珠比越大，植物远交程度越高，植物传粉效率也越高[23-24]。杂交指数以山樱桃的花部结构特征为依据，花药与柱头在花朵开放时期存在空间距离，会影响授粉的成功率。对野生山樱桃生殖特征的研究表明，山樱桃的繁育系统以异交为主，自交亲和。繁育系统的类型一般受植物性别系统的影响，自然界中只有极少数植物为纯粹的自交种和异交种[25]。有研究表明，多数异交植物可以通过自交授粉进行繁殖，而自交植物也可以进行异交授粉的繁殖[26-27]。

4 结 论

本试验首次对产于天津的野生山樱桃花部综合特征、开花过程、花粉活力、柱头可授性及生殖特征进行研究。结果表明，I2-KI染色和醋酸地衣红染色的结果与离体培养的实验结果差异显著，不适于山樱桃花粉活力测定；15 g·L-1蔗糖浓度下培养6 h时山樱桃花粉萌发率达到最大值；山樱桃花药开裂散粉3 h达到最大花粉萌发率(53.2%)；花粉常温保存9 d失去活力，-4 ℃下保存72 d完全失去活力，-20 ℃保存120 d完全失去活力。贮藏温度越低，越有利于山樱桃花粉保存。野生山樱桃盛花期花朵展开较大时具有较强柱头可授性，与花粉活力高的时间有所重叠，有利于提高人工授粉成功率。其繁育系统表现为以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者。本试验为研究天津地区野生山樱桃的引种栽培提供理论依据，对丰富樱桃樱花种质资源具有一定的贡献。