HPLC法测定消栓颗粒剂中黄芪甲苷的含量

王法宇 吴 迪 赵凤明 袁家欣

1.北京医药集团职工大学,北京 100079;2.吉林省白城市食品药品检验所，吉林 白城 137000；3.吉林敖东鹿业有限责任公司,吉林 长春 133700

消栓颗粒剂出自清朝名医王清任的《医林改错》卷下瘫痿论方[1]。该方特点为重用黄芪为君药，其黄芪用量是其它活血药总和的约3倍，方中重用的黄芪中含有多糖及黄芪甲苷[2-4],同时黄芪还具有抗炎、增强免疫[5-6]、抗氧化[7]、保护心脏[8]、调脂[9]、降血糖[10]等作用。黄芪甲苷作为黄芪的主要有效成分，在我国药典中有含量测定并有相关含量限度规定[11]。本研究建立消栓颗粒剂中黄芪甲苷含量测定方法，进一步细化药品的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器 液相色谱仪(Agilent 1100) 检测器为四元泵二极管阵列，数据转换器为Agilent35900E蒸发散射检测器(SEDEX-55)，单元泵(DXNamax-SD-200) ，AgII空气发生器电子天平(Mettler instrument Corp)，超声波提取器(型号GT-350W型济宁科特超声电子有限公司)。

1.2 药品 消栓颗粒( 自制的三批药品分别为20190905 20190904 20190902)自制的黄芪阴性对照；黄芪甲苷对照品(中检所110781201717)；乙腈(色谱纯)；其它试剂(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 ①供试品溶液的制备：取本品7 g，精密称定，加氨试液40 mL移至具塞三角瓶中摇匀，密闭，过夜。取此提取液以40 mL水饱和正丁醇萃取，共萃取3次后合并正丁醇萃取液，将其水浴蒸干，残渣以甲醇溶解后移至5 mL容量瓶中，并稀释到刻度，然后取上清液，用滤膜过滤(0.45 μL)，即得；②对照品溶液配制：称取黄芪甲苷对照品0.5 mg加甲醇配制成每毫升含0.5 mg的溶液；③阴性对照：按上述工艺配制缺黄芪的阴性对照品溶液。精密吸取上述①②③各10 μL测定。结果①和②在相同时间内出现相对应的色谱峰，而③则未出现。相关图谱如图1所示。

2.2 色谱条件 Nanologica SVEA C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(35∶65)为流动相；蒸发光散射检测器。1.0 mL/min为流速，柱温为25 ℃，理论塔板数不低于4000，以黄芪甲苷峰计算。进样量为10 μL。

2.3 标准曲线与线性范围 黄芪甲苷对照品溶液(浓度为0.47 mg/mL)精密吸取4～30 μL，进行测定峰的面积，纵坐标(Y)为峰面积log值，横坐标(X)为进样量log值，回归处理，结果显示黄芪甲苷在0.2742～1.1492 μg范围内，峰面积的积分值与进样量之间呈良好的线性关系，回归方程为Y=1.4709X+2.7033，R=0.9994(n=6)。

2.4 精密度试验 精密地吸取上述同一对照品溶液10 μL，在测试的条件和测试的地点相同的前提下，重复进样6次后测定黄芪甲苷的峰面积，并计算相对标准偏差，取6次RSD的平均值以记录。结果表明黄芪甲苷的平均峰面积为5527.88，RSD为1.45%，该方法精密度较好。

2.5 重复性试验 同批次的样品为供试品，按上文所述的方法配制供试品溶液，依上述方法重复进行含量平行测定。黄芪甲苷重复性试验结果的平均值为7919.53，RSD为1.63%。由以上可知，此方法的重复性良好。

2.6 稳定性实验 取本品供试品溶液，分别放置0～24 h，每次吸取10 μL测定。结果平均峰面积为7519.55，RSD为1.87%。结果显示，供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率 精密地称取已知含量的同一样品6份，其每份黄芪甲苷含量约1.25 mg。精密地加入对照品溶液(含黄芪甲苷为1.2404 mg)按以上样品测定项下的方法提取，测定含量并计算回收率，平均回收率为99.16%，RSD为1.21%，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.8 检出限 取黄芪甲苷对照品配置成浓度为0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.01 mg/mL的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，进样量为10 μL，计算不同进样量的信噪比，经测定，浓度为0.005 mg/mL的黄芪甲苷进样量为10 μL时，其信噪比为3，因此确定黄芪甲苷的最低检出限为0.05 μg。

2.9 样品含量测定 取10批次的上述样品，按供试品溶液的方法配制并测定其峰面积，再用外标两点法对数方程计算样品中黄芪甲苷的含量，测定结果见表2。考虑到每批药材之间质量差异和生产实际，最后将黄芪甲苷的含量定为不低于0.70 mg/g。

表2 消栓颗粒剂中的黄芪甲苷的含量

3 讨论

黄芪为方中君药，其主要成分黄芪甲苷的含量测定可以做为控制消栓颗粒剂质量的指标性成份。本试验结果显示，黄芪甲苷平均加样回收率为 99.16%，RSD 为1.21%。样品中黄芪甲苷出峰时间为15.6 min，且样品峰与其他峰的分离度很好。阴性对照试验表明，除黄芪外的其他原辅料不干扰样品中黄芪甲苷的含量测定。表明本结果准确，重复性良好，可用于对消栓颗粒剂的质量控制，从而保证临床应用中制剂的疗效和安全。