磺胺嘧啶锌软膏联合依诺沙星软膏对烫伤感染小鼠菌落数及愈合的影响

（郑州大学附属洛阳中心医院烧伤整形科，洛阳 471000）

烫伤后皮肤组织的防御功能破坏，导致病灶处皮肤组织及细胞出现大量坏死，细菌更容易长时间定植[1]。因此，有效控制烫伤后细菌感染，对于加快皮肤愈合具有重要意义。目前，烫伤后感染的细菌以铜绿假单胞菌最为常见。近些年，在烫伤病灶检测细菌阳性率已经是临床主要检测方式[2]。烫伤后机体血清中锌水平降低，导致创面组织再生能力降低，需要通过增加外源性锌水平，从而加快创伤皮肤组织愈合和上皮细胞繁殖[3]。依诺沙星（Enoxaein，ENX）为唆诺酮类抗菌药，对多重耐药的肠杆菌科仍能降低铜绿假单胞菌耐药，加快杀菌能力，提高抗菌作用。磺胺嘧啶锌主要成分为磺胺嘧啶和锌，磺胺嘧啶抗菌作用较好，锌能够提高皮肤组织再生[4]，但鲜有采用该药物对烫伤感染创面菌落及愈合率的研究。本研究通过建立烫伤感染小鼠模型，观察磺胺嘧啶锌软膏联合依诺沙星软膏对其疗效影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物、实验菌株、主要药物和试剂

SPF级BALB/c 小鼠（辽宁生物技术）；铜绿假单胞菌标准质控株A TCC27853（上海北诺生物）；LB 营养琼脂（上海博湖生物）；结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）抗体（北京百普赛斯生物）；戊巴比妥钠、多聚甲醛（安徽丰源生物）；苏木精伊红试剂盒（北京诺博莱德科技）；ELISA 试剂盒（上海抚生实业）。

1.2 烫伤模型建立

将所有小鼠采用2%戊巴比妥钠按照40～60 mg/kg 麻醉后脱毛，面积约25 cm2，麻醉后，将大鼠固定到自制的烫伤板上，后将模板置于点热恒温的水浴锅上，100℃的沸水持续烫伤15 s，用纱布擦拭干净，形成Ⅱ级烫伤。

1.3 新鲜菌液和普通肉汤琼脂培养皿的制备

将-80℃冷藏的ATCC27853 菌群，复苏后接种到1.5%琼脂的肉汤培养基上，恒温培养，用接种环挑选几个菌落，置于无菌EP 中，浓度为1×10 CFU/mL，后取琼脂粉和肉汤培养基，溶于高温蒸馏水中，加热后溶解，充分溶解后封口，灭菌后，自然冷却后备用，

1.4 感染模型建立、分组及用药方法

所有小鼠取铜绿假单胞菌标准质控株A TCC27853 在创伤处进行轻轻擦刮涂抹1 min，菌液完全吸收后。随机分为3组，模型组、对照组和干预组，每组7 只小鼠。药物干预：均在接种1 d后开始药物干预，对照组采用依诺沙星软膏（中国福建金生只要股份有限公司；20043570，规格：10 g：0.1 g），1 d 2次；干预组在依诺沙星软膏均匀涂抹后形成白色膜采用磺胺嘧啶锌软膏（河南全宇制药股份有限公司，H41022525，规格：20 g），1 d 2次后采用无菌纱布覆盖，纸胶布固定，基础组采用凡士林干预，3组均治疗8 d。

1.5 菌落计数、感染创面愈合率及愈合时间变化

分别在治疗后1、4 d 和8 d 时胶头滴管取少量生理盐水由创面的一端滚动至另一端，放入无菌EP管中。稀释后，采用不同浓度的菌液均匀分布在6 cm 的普通肉汤琼脂培养皿中，恒温培养，进行菌落计数。

分别在治疗后1、4 d和8 d时，采用纸片方框固定创面面积尺寸，每天拍照观察进行创面愈合程度及愈合时间，采用 IPP 6.0图形分析软件进行分析。

1.6 H-E染色检测病理变化

随机颈部脱臼处死4 只小鼠，取创面组织，甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋后，H-E 苏木精染色，中性树胶封固。观察组织病理变化。

1.7 ELISA 检测炎性指标

治疗结束后，剩余小鼠抽取眼眶静脉血2 mL，检查白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达，按照ELISA 说明术进行操作，离心20 min，加入100 μL 样本37.5℃进行冲洗，静置60 min，检测炎症因子水平。

1.8 免疫印迹检测创伤组织中CTGF 蛋白表达

创伤组织加入蛋白裂解液，离心，后将取得溶液加入上样孔。电泳后，取下PVDF 膜TBS 浸泡10 min，密封，PBS 反复冲洗，然后加一抗（1∶500），40℃杂交1 d，重复上述清洗步骤，加入二抗（1∶2 000），杂交2 h。将膜浸入ECL 工作液，随后进行检测，获取电泳图像。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，各组菌落计数创面愈合率及时间、病理、血清炎症因子、CTGF 蛋白表达以±s表示，采用t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠创面菌落计数比较

3组在治疗1 d 时创面菌落计数差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组及干预组在4 d 和8 d 创面菌落计数低于模型组（P＜0.05），干预组与对照组创面菌落数量相差较小（P＞0.05）；每组多个时间点比较，干预组及对照组随着时间增加，菌群数量减少（P＜0.05）；创面愈合率2组治疗1 d 时差异无统计学意义（P＞0.05），对照组在治疗4 d 和8 d 时创面愈合率低于干预组（P＜0.05）；每组多个时间比较，愈合率均随着时间增加而升高（P＜0.05）；愈合时间干预组高于对照组（P＜0.05）（表1）。

表1 各组小鼠创面菌落计数比较（n=7，±s）

表1 各组小鼠创面菌落计数比较（n=7，±s）

*P＜0.05 vs 模型组

组别 1 d 4 d 8 d模型组 4.74±0.45 4.67±0.47 4.90±0.55对照组 4.58±0.49 3.82±0.34* 3.62±0.42*干预组 4.68±0.42 3.77±0.35* 3.55±0.43*

2.2 各组小鼠创面愈合率和愈合时间比较

创面愈合率2组治疗1 d 时差异无统计学意义（P＞0.05），对照组在治疗4 d 和8 d 时创面愈合率低于干预组（P＜0.05）；每组多个时间比较，愈合率均随着时间增加而升高（P＜0.05）；愈合时间干预组短于对照组（P＜0.05）（表2）。

表2 各组小鼠创面愈合率和愈合时间比较（n=7，±s）

表2 各组小鼠创面愈合率和愈合时间比较（n=7，±s）

*P＜0.05 vs 对照组

组别 愈合率（%）愈合时间（d）1 d 4 d 8 d对照组 7.03±5.03 15.35±6.49 21.55±6.40 33.67±1.57干预组 10.47±4.77 22.09±7.39* 30.79±8.45* 28.65±1.37*

2.3 各组小鼠创面组织病理比较

对照组创伤组织炎症改善，坏死组织减少，干预组肉芽组织生长活跃，皮肤组织结构较完整，无显著炎症浸润（图1）。

2.4 治疗后各组小鼠血清炎症因子水平比较

对照组小鼠血清中IL-16、IL-10 和TNF-α 水平高于干预组（P＜0.05）（表3）。

表3 治疗后各组小鼠血清炎症因子水平比较（±s）

表3 治疗后各组小鼠血清炎症因子水平比较（±s）

#P＜0.05 vs 对照组

组别 IL-6 IL-10 TNF-α对照组 303.35±38.09 231.41±24.50 122.89±14.09干预组 102.45±24.66* 155.49±17.83* 84.38±12.39*

2.5 创伤组织的CTGF 蛋白表达变化

CTGF 蛋白分子量为38 kD，干预组小鼠创伤组织中CTGF 蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）（图2）。

2.6 磺胺嘧啶锌软膏联合依诺沙星对烫伤小鼠模型愈合的影响

第1天两组创面有浆液渗出，并伴有红肿现象；第7 天渗出液开始凝固、干燥，形成痂皮，创面面积见缩小创面边缘部分区域；第14天，肉芽组织明显呈向心性、团块状、瘤性增生（图3）。

3 讨论

烫伤感染创面修复影响的因素较多，创面感染会累及皮肤组织，加快周围组织感染。目前，改善上述症状主要是依靠皮肤残留的上皮组织，形成皮岛，提高融合速度[5]。目前，治疗创面感染的目的在于避免感染和促进上皮组织修复再生。目前，临床对于本病的治疗方法较多，外敷药物贯穿整个用药周期，能够提高生理利用度，减少患者皮肤疼痛，加快创面愈合，已经成为众多学者研究重点[6-7]。

烧伤感染是烧伤疾病中一个重要发展阶段，出现严重烧伤患者，创面会有渗出液，外部环境有利于细菌的生长和繁殖[8]。大量研究表明在烧伤患者创伤中检测出铜绿假单胞菌检出率较高。铜绿假单胞菌是伤口创面感染为主要临床感染来源，感染后皮肤黏膜防御功能减退，更有利于细菌累及深层皮肤组织，出现免疫功能紊乱，加大对细菌的易感性，如不及时治疗预后较差[9-10]。磺胺嘧啶锌软膏是临床用于烫伤的外用药物，其中主要成分为磺胺嘧啶及锌，前者能够对多种病原菌具有抑制作用，后者能够加快创面愈合作用。以往研究表明，对烫伤感染创面皮肤组织进行锌元素检验，显示创伤组织中锌的含量低于周围正常皮肤组织[11]。倪晓霞等[12]研究显示，磺胺嘧啶锌软膏中成分锌能够加快皮肤纤维细胞的修复及再生，提高胶原合成，加快创面愈合。磺胺嘧啶锌软膏中磺胺嘧啶抗菌能力较强，与临床用药磺胺甲恶唑相似，属于广谱抑菌药物，能够有效抑制铜绿假单胞菌繁殖再生，能够提高愈合率，不良反应少。本研究结果显示，采用磺胺嘧啶锌软膏能够显著减少铜绿假单胞菌数量，加快创面愈合，降低愈合时间，这与Dehkordi 等[13]研究结果相似，说明磺胺嘧啶锌软膏能够治疗烫伤感染小鼠，疗效较好。

图1 各组小鼠创面组织病理比较，×200。A：对照组；B：干预组。黑色箭头表示肉芽组织，白色箭头表示炎症细胞.

图2 各组小鼠创伤组织的CTGF 蛋白表达。A：对照组，B：干预组.

图3 各组烫伤小鼠模型愈合的影响。A：对照组，B：干预组。A1、B1：1 d；A2、B2：7 d；A3、B3：14 d.

烫伤感染后皮肤组织出现大面积坏死，持续性的全身感染不可避免，机体出现炎症浸润后，中性粒细胞会活化从而释放大量的活性氧等物质，加快创面组织的持续损伤[14-15]。同时，巨噬细胞也会被激活，白细胞介素及肿瘤坏死因子等会释放，加大炎症反应，加重烫伤感染的发生及发展，严重者导致其他疾病产生，危害患者生命安全[16]。磺胺嘧啶锌软膏刺激性较小，能够增加创面血液循环，提高局部代谢水平，减少渗透，降低炎症浸润，有利于组织愈合和结痂形成，加快好转[17]。本研究显示，磺胺嘧啶锌软膏能够降低小鼠血清中TNF-α、IL-10、IL-6水平，这与宋锡刚等[18]研究结果相似，说明磺胺嘧啶锌软膏能够通过降低炎症因子水平，加快血液循环，加快皮肤组织痊愈。

CTGF 是血小板生长因子刺激内皮细胞产生的蛋白，水平升高有利于提高皮肤组织再生。Guo 等[19]研究显示，对烫伤感染小鼠组织提高CTGF 水平有利于加快创伤感染组织修复。研究表明，磺胺嘧啶锌软膏能够提高组织中CTGF 水平，但是具体研究机制还需要进一步研究[20]。本研究结果表明，磺胺嘧啶锌软膏能够提高CTGF 水平，加快组织愈合，这与Chen[21]研究结果相似，说明磺胺嘧啶锌软膏能够通过提高CTGF 水平，增加烫伤感染组织痊愈能力，加快好转。

综上所述，磺胺嘧啶锌软膏能够减少烫伤感染小鼠创伤铜绿假单胞菌数量，加快创面愈合，有利于减少组织炎症，疗效较好。