CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

陈红，赵风光，李战胜，杨家明，韩双艳

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

肥胖、糖尿病等代谢疾病已经成为全球性危机，热量高的蔗糖等甜味剂的过多摄入造成能量过剩是其中一个重要原因[1]。D-阿洛酮糖（D-psicose）是近年发现的一种具有特殊保健作用的功能性甜味剂，甜度相当于蔗糖的70%，热量只有蔗糖的0.3%[2,3]。有研究报道，D-阿洛酮糖可以通过抑制关于脂质合成的酶活性而减轻腹部肥胖（Abdominalobesity），因此D-阿洛酮糖可用作减肥食品（diet food）的有效成分[4]。

当前的研究报道，大多集中在大肠杆菌中表达酮糖3-差向异构酶，然后用重组酶催化果糖生产D-阿洛酮糖[5,6]。就食品安全性来说，重组大肠杆菌进行D-阿洛酮糖生产并不太适合D-阿洛酮糖主要用于食品添加的需求。酿酒酵母一直被美国FDA（Food and Drug Administration）认为是GRAS（Generally Recognized As Safe）生产菌株，具备安全无致病性、遗传背景清晰、培养简单和繁殖迅速等优势，是功能性甜味剂D-阿洛酮糖的理想生产菌株[2,7]。

在酿酒酵母体内，己糖激酶同工酶2HXK2（hexokinase isoenzyme 2，GenBank：CAA96973.1）可以将果糖磷酸化形成果糖-6-磷酸，从而进入糖酵解代谢[8]。因此，有必要将hxk2基因敲除或功能弱化，从而降低宿主酿酒酵母对果糖消耗且改善目的产物D-阿洛酮糖的生产。在酿酒酵母中，利用蔗糖为底物生产果糖和乙醇时，HXK2的缺陷可以抑制细胞对果糖的消耗[9]。另外，通过利用分泌菊粉酶的酿酒酵母将菊芋转化为果糖的生产中，HXK2的缺失在减少酵母对果糖利用中发挥重要作用[10]。

CRISPR/Cas9技术被誉为第三代基因组编辑技术，2013年首次应用在酿酒酵母中[11]，随后因其具有低成本、易操作、普适性和高效性等多种优点[12]，在酿酒酵母中迅速得到推广应用[13-15]。目前，II型CRSPR/Cas9系统应用广泛；在该系统中，gRNA由crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）组成，更换20 bp靶序列即可对不同基因进行编辑[16]；Cas9核酸酶介导形成的DNA双链断裂通过donor DNA可修复，进而实现基因的定向编辑。本研究尝试开发CRISPR/Cas9共表达系统，对酿酒酵母hxk2基因进行无痕编辑，以期降低酿酒酵母作为宿主菌对果糖的消耗，为后续在酿酒酵母体内以D-果糖为原料转化生产D-阿洛酮糖提供可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌Top10为本实验室收藏，用于质粒的构建和扩增；酿酒酵母BY4741为本实验室收藏和保存。实验中所使用和构建的质粒见表1。

表1 本实验所用质粒Table 1 All the plasmids used in this study

1.1.2 培养基

Luria-Bertani（LB）培养基：用于大肠杆菌的生长（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨和10 g/L NaCl），固体培养基则还需要添加琼脂粉2 g/L；转化子筛选时需要添加氨苄青霉素至浓度100 μg/mL。YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培养基：用于酿酒酵母的生长（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖），固体培养基则还需要添加琼脂粉2 g/L。SD-U培养基：用于筛选酿酒酵母转化子（6.7 g/L酵母氮源YNB、0.66 g/L ΔUra DO Supplement和20 g/L葡萄糖）。YPF培养基：含果糖培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L果糖），用于评估酿酒酵母对果糖的消耗情况。

1.1.3 主要试剂和仪器

KOD DNA聚合酶购自TOYOBO公司；限制性内切酶BcuI和SacII及T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；2×UTaq PCR MasterMix及DNA marker购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；琼脂糖凝胶片段回收试剂盒以及质粒抽提试剂盒购自美基生物；Seamless Assembly Cloning Kit无缝重组试剂盒购自美国Clone smarter；引物合成由擎科生物技术有限公司完成；序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要仪器有：紫外分光光度计，美国Unico公司；PCR仪，美国Bio-Rad公司；恒温培养箱，广东环凯微生物科技有限公司；Mini-Beadbeater研磨珠均质器，美国Biospec公司。

表2 实验所用引物Table 2 Primers used in this study

图1 CRISPR/Cas9共表达质粒pYES2-CG-Δhxk2的构建Fig.1 The construction of pYES2-CG-Δhxk2

1.1.4 引物

实验中用到的引物见表2。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建

CRISPR/Cas9共表达质粒pYES2-CG-Δhxk2的构建流程如图1所示。主要分为两步：

1）以pYES2和rDNA-PPGK1-Cas9-TCYC1为出发材料，构建得到游离型Cas9蛋白表达载体pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1。基本过程是：（1）制备pYES2载体片段：以pYES2质粒为模板，使用引物对F1/R1扩增，获得带有多克隆位点的pYES2载体片段，预期片段大小4499 bp；（2）制备Cas9基因片段：使用引物对F2/R2，以rDNA-PPGK1-Cas9-TCYC1质粒为模板，获PPGK1-Cas9-TCYC1表达盒，预期片段大小5428 bp；（3）连接和转化：上述两个片段用clone smarter无缝重组试剂盒进行连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB（LBA）平板上筛选；（4）转化子鉴定：从LBA平板挑选转化子，利用引物对F3/R3进行菌落PCR，确定阳性克隆，抽提质粒送生工测序。

2）以pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1和gRNA-trp-HYB为出发材料构建得到pYES2-CG-Δhxk2。基本过程是：（1）制备靶向hxk2的PSNR52-gRNA-TSUP4表达盒：以gRNA-trp-HYB为模板，利用引物对F4/R4和F5/R5，扩增启动子PSNR52和含20 bphxk2靶序列（5’TTCCTTTGGCACATCGGCCA3’）的gRNA结构序列；随后使用引物对F4/R5，经融合PCR获得PSNR52-gRNA-TSUP4表达盒，预期大小为439 bp；（2）酶切和连接：使用限制性内切酶BcuI和SacII，对pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1和PSNR52-gRNA-TSUP4进行双酶切，对切胶回收后片段进行连接；（3）转化：将上述连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB（LBA）平板筛选；（4）转化子鉴定：从LBA平板挑选转化子，利用引物对F6/R5进行菌落PCR，确定阳性克隆，抽提质粒送生工测序。

1.2.2 Donor DNA的构建

设计带有15 bp重叠区的引物对F7/R7，进行重叠PCR反应，切胶回收，获得Donor DNA片段，用于酿酒酵母转化。PCR扩增条件为：94 ℃变性5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 12 s，循环30次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 电转化酿酒酵母以及转化子的鉴定

根据文献[17]中的电击转化方法制备感受态细胞并进行转化，具体如下：制备酿酒酵母BY4741的感受态细胞，将质粒pYES2-CG-Δhxk2和donor DNA片段共转化，涂布SD-U平板培养2～3 d。在超净台挑取转化子，利用引物对F8/R8进行PCR鉴定，预期片段大小683 bp，随后将所得PCR产物交由生工测序。

工程菌BY4741-Δhxk2的摇瓶发酵：挑取工程菌BY4741-Δhxk2单克隆，于10 mL YPD培养基，30 ℃、200 r/min培养24 h；然后转接于25 mL YPD中，控制起始OD600为0.2，30 ℃、200 r/min培养22 h。

1.2.4 果糖含量的测定

取1 mL发酵液转入含0.74 g玻璃珠的破碎管中，利用均质仪进行间歇机械破碎，每破壁1 min之后放在冰上1 min，重复8次。破壁结束后，于8000 r/min离心5 min，将上清通过0.22 μm滤膜过滤，随后进行HPLC分析。检测条件为：Waters 2695型高效液相色谱仪，Shodex SP-0810色谱柱，柱温为65 ℃，流动相为超纯水，流速为1 mL/min，Waters 2424 ELSD检测器。

果糖消耗速率的计算公式如下：

式中：M1是发酵培养14 h时果糖含量，M0是起始培养基中的果糖含量；T是14 h。

1.2.5 数据处理

运用Microsoft Excel 2010进行数据平均值处理以及计算标准偏差，采用Origin 8.0软件作图，利用SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 游离型CRISPR/Cas9共表达质粒的构建与鉴定

2.1.1 质粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1的构建

PCR扩增pYES2载体片段（4499 bp）和含强启动子PGK1的Cas9表达盒PPGK1-Cas9-TCYC1（5428 bp），相关PCR片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果见图2a、b。将上述两步获得的载体和PPGK1-Cas9-TCYC1表达盒无缝连接，转化TOP10感受态，挑选转化子进行菌落PCR，菌落PCR产物经琼脂糖凝胶点泳鉴定（图2c），与理论值631 bp相符。随后阳性转化子摇瓶培养后抽提质粒送生工测序，测序结果证明质粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1构建成功，符合预期。

图2 质粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1构建过程中PCR产物鉴定电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA fragments for pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1 construction

2.1.2 靶向hxk2的gRNA构建

利用在线工具CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）[18]，设计了用于靶向hxk2基因的20 bp序列（5’TTCCTTTGGCACATCGGCCA3’）。设计含有该20 bp在内的引物F5，该引物5'端与启动子SNR52的5'端具有19 bp重叠区域。利用引物对F5/R5对质粒gRNA-trp-HYB扩增得出终止子TSUP4，利用引物对F4/R4对质粒gRNA-trp-HYB扩增得出启动子PSNR52，最后对这两个片段进行融合，获得含启动子PSNR52的靶向hxk2基因gRNA结构序列，命名为gRNA-Δhxk2。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认融合片段的长度与预期结果相符见图3。

图3 表达组件gRNA-Δhxk2的扩增Fig.3 Amplification of expression components gRNA-Δhxk2

2.1.3 靶向hxk2的CRISPR/Cas9共表达质粒的构建

经限制性内切酶BcuI和SacII处理的pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1与相同双酶切处理过的gRNA-Δhxk2片段体外连接，连接产物转化TOP10感受态，挑选转化子进行菌落PCR来确定阳性克隆，菌落PCR产物大小与理论值147 bp较符合（见图4）。随后转化子培养后抽提质粒送生工测序，测序结果证明连接成功，获得可用于己糖激酶hxk2编辑的质粒pYES2-CG-Δhxk2。

图4 重组大肠杆菌TOP10/pYES2-CG-Δhxk2鉴定Fig.4 Diagnostic of TOP10/pYES2-CG-Δhxk2

2.1.4 donor DNA片段的构建

图5 donor DNA构建的PCR产物凝胶电泳图Fig.5 Agarose gel electrophoresis of donor DNA

引物F7的3’端含有15 bp序列与引物R7的3’端重叠（图5a），通过PCR直接将引物融合，构建得到含有hxk2 PAM位点上下游的同源臂片段donor DNA（90 bp），该片段第43为T，第44位为A，第45位为A，可以在后续Cas9介导的同源修复中将hxk2基因位点的第44位C突变为A，45C被删除，46A移码至45位置，实现己糖激酶同工酶2移码突变及提前终止。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物大小与理论值相符（图5b）。

2.2 己糖激酶2 HXK2缺陷株的建立

将pYES2-CG-Δhxk2和donor DNA共转化酿酒酵母BY4741感受态细胞，涂布SD-U筛选平板。转化子用F8/R8为引物对菌落PCR，产物预期大小为683 bp，与电泳结果相一致（图6a）；随后将PCR产物送上海生工测序，结果证明工程菌中第44位C突变为A，同时缺失了hxk2基因ORF的第45位碱基序列，使第46位A移码，从而形成TAA，造成了移码突变及提前终止（图6b）。酿酒酵母的hxk2全长1461 bp[19]，因而在上游第45位开始的移码突变，完全可能引起整个蛋白失活。因而酿酒酵母缺陷株BY4741-Δhxk2构建成功。相比于两步法依次将Cas9和gRNA表达质粒转化至酿酒酵母体内进行基因编辑[20,21]，该共表达质粒一定程度上缩短了实验操作过程以及减少了筛选标记的使用。

图6 突变菌株BY4741-Δhxk2构建Fig.6 Construction of mutant BY4741-Δhxk2

2.3 酿酒酵母工程菌对果糖消耗情况

图7 酿酒酵母突变菌株BY4741-Δhxk2发酵性能测定Fig.7 Fermentation properties of original strains and mutant strains BY4741-Δhxk2

使用YPF培养基对菌株BY4741-Δhxk2进行培养，评估己糖激酶hxk2缺陷工程菌对果糖的消耗情况，结果见图7a。在14 h培养期间（14 h之后果糖彻底消耗），缺陷株BY4741-Δhxk2和野生型BY4741对果糖的消耗速率分别为3.35 mg/h和3.58 mg/h，二者存在显著差异（p＜0.05）。同野生型相比，己糖激酶hxk2缺陷株的果糖消耗降低了6.42%，Yu[10]曾通过对hxk2基因进行敲除实现酵母对果糖的消耗降低。初步实现了我们的预期目的：通过缺陷己糖激酶hxk2，阻断果糖磷酸化进入糖酵解代谢被酵母作为碳源利用。有意思的是，继续发酵培养到22 h后，缺陷株BY4741-Δhxk2和对照BY4741的OD600分别为8.65和8.13，两者有显著差异（p＜0.05），如图7b所示；相比于野生型BY4741，BY4741-Δhxk2具有较高的OD600，且提高了6.40%。而且从培养8 h后，缺陷株细胞生长量一直在野生型之上，显示出来较好的生长优势。前期研究表明[10,22]，hxk2敲除菌的生长情况同样优于野生型。Diderich[22]指出己糖激酶2（HXK2）的缺失会增强细胞的呼吸作用，从而可以避免发酵代谢中产生的乙醇抑制，因此推测hxk2敲除菌细胞生长量得以提高。结合缺陷株果糖消耗慢、生长性能好的优势，可以考虑将缺陷株BY4741-Δhxk2作为出发菌株，进一步构建利用果糖生产D-阿洛酮糖的新型酿酒酵母工程菌。

2.4 讨论

在过去的几年中，CRISPR/Cas9技术在基因组编辑方面经历了快速的发展，并且在不同的生物体中被广泛应用，以操纵DNA序列[14]。本实验采用CRISPR/Cas9系统，构建了以URA3标记，Cas9和gRNA共表达游离型质粒pYES2-CG-Δhxk2，成功编辑了酿酒酵母己糖激酶hxk2，得到了预期的hxk2缺陷株BY4741-Δhxk2。相比于众多将Cas9和gRNA单独表达的文献报道[21,22]，这种共表达质粒的应用有效地减少了筛选阳性转化子时所用的标记，缩短了基因编辑所需的实验周期，但就是否能够同时实现多个基因编辑，有待进一步实验研究。菌株发酵培养过程显示，相比于野生型BY4741，缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率下降了6.42%，说明hxk2基因的功能缺失对酿酒酵母利用果糖有一定的抑制作用，这与之前的相关报道结论也一致[10]。但是，值得一提的是，相比于野生型，BY4741-Δhxk2的细胞数量（OD）提高了6.40%，表现出一定的生长性能优势。为后期，在缺陷株基础上开发新的D-阿洛酮糖生产菌株提供了可能。

3 结论

本研究通过构建Cas9和gRNA共表达单质粒pYES2-CG-Δhxk2，采用一步法转化，实现了酿酒酵母中hxk2基因的敲除，获得对果糖代谢较缓慢的突变株BY4741-Δhxk2。相比于传统两步法转化筛选，本方法缩短了实验所需时间，为CRISPR技术的进一步升级改良提供了思路。同时，研究获得了果糖低消耗、生长性能优良的缺陷株酿酒酵母BY4741-Δhxk2，为符合GRAS的酿酒酵母细胞以果糖为原料生产阿洛酮糖奠定了基础。