酿酒原料及白酒中黄曲霉毒素B1的测定方法改进

任 璐，罗冠龙，燕玲娟，刘丽丽，闫宗科

（陕西西凤酒股份有限公司，陕西宝鸡 721400）

白酒酿造原料主要有高粱、大麦、小麦、豌豆等，因酿酒原料用量较大，酒厂一般对原料批量购买，进行存储使用，一旦购买原料存在安全隐患或存储不当造成霉变，将产生一些对人体有害的霉菌毒素类物质，其中黄曲霉毒素B1（AFTB1）对人体健康的危害最大，为强毒性、强致癌性物质，已被世界卫生组织癌症机构（IARC）列入一级致癌物。

为了严格控制黄曲霉毒素对人体的危害风险，从而保障消费者的安全，美国、日本、加拿大等多个国家已发布了有关黄曲霉毒素最大限定量的规定，我国GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》标准中也规定了粮食中的真菌毒素B1的最大限量，凤香型酿酒原料（高粱、大麦、小麦、豌豆）中的最大限量分别为10µg/kg、5µg/kg、5µg/kg、5µg/kg。尽管如此，但仍然存在一定的风险，因此建立准确、高效的检测方法尤为重要。

目前对于黄曲霉毒素的检测方法主要有液相色谱-荧光检测法[1-3]、酶联免疫吸附筛查法[4-5]、高光谱检测法[6-7]、薄层色谱法[8]、同位素稀释液质联用法[9-11]等。本研究建立了酿酒原料及白酒中AFTB1的液质联用（HPLC-MS/MS）检测法。该方法样品前处理较简单、检测效率高、准确度高、检测限更低，进一步满足了消费者对食品安全更高的期望和国家对食品检测更严的要求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

样品：原料（高粱、大麦、小麦），成品酒取自于陕西西凤酒股份有限公司。

试剂：甲酸、乙腈、甲醇、乙酸铵（分析纯）、超纯水。

仪器设备：高效液相色谱串联质谱仪（岛津公司HPLC-20A 高效液相色谱仪串联LCMS-8045 质谱仪），万分天平（梅特勒-托利多公司），氮吹仪（天津奥特赛恩斯），免疫亲和柱（德国拜发）。

标准品：黄曲霉毒素B1（AFTB1纯度≥98%，Pribo 公司），同位素内标13C17-AFTB1（纯度≥98%，Pribo公司）。

1.2 标准溶液的配制

AFTB1标准储备液：称取AFTB1为1.0 mg，用乙腈定容至100 mL 容量瓶，配制成10µg/mL 标准储备液。

同位素内标13C17-AFTB1工作液：准确移取0.5 µg/mL 的13C17-AFTB10.8 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成40 ng/mL的同位素内标工作液。

AFTB1系列标准工作液：移取AFTB1标准储备液1.0 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 ng/mL的AFTB1中间标准液。再分别移取AFTB1中间标准液5 µL、10 µL、50 µL、100 µL、200 µL、500 µL、800 µL、1000 µL 至10 mL 容量瓶中，分别加500 µL 的40 ng/mL 同位素内标工作液，用初始流动相定容，配制成浓度为0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、8.0 ng/mL、10.0 ng/mL 的系列标准工作液，过0.22µm 滤膜，待上机。

1.3 仪器参数条件

液相条件：色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0 mm I.D*150 mm L.,3.0 μm)；进样量：10µL；流动相：A：0.02%甲酸-2 mmol/L 乙酸铵，B：甲醇；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；驻留时间：10 ms。洗脱方式：梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱

质谱条件：扫描方式：多级反应监测（MRM）；离子源：ESI，正离子模式；加热块温度：450 ℃；DL温度：250 ℃；雾化气流速：3.0 L/min；干燥气流速：15 L/min；离子源接口电压+4.5；驻留时间：10 ms。

1.4 试验方法

1.4.1 样品提取

酿酒原料：准确称取酿酒原料5 g样品于50 mL离心管中，加入250µL 同位素内标工作液，旋涡振荡混匀，加入20 mL 甲醇-水（70+30），涡旋混匀，静置30 min 后用均质器均质3 min，过玻璃纤维滤纸。准确移取滤液4 mL 加入12 mL 的超纯水，混合均匀，待净化。

酒样：称取2 g 酒样，加入100 µL 同位素内标工作液，加入4 mL水，振荡混匀，待净化。

1.4.2 净化

原料：待免疫亲和柱保护液流尽后加入上述溶液，以1 滴/s 的流速通过免疫亲和柱，流完后用2×10 mL 超纯水淋洗免疫亲和柱，自然重力流干后挤干小柱，准确加入2×0.5 mL甲醇洗脱，再加1 mL水挤干，收集于比色试管中，过0.22µm 有机滤膜，待上机。

酒样：待免疫亲和柱保护液流尽后加入1.4.1中酒样溶液，自然重力下滴，流完后加10 mL 去离子水淋洗柱子，挤干；加2×0.5 mL 甲醇洗脱，再加1 mL 水挤干，收集于比色试管中，过0.22 µm 有机滤膜，待上机。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

流动相不仅运载样品，而且对于物质的分离、响应至关重要。AFTB1液质检测常用流动相为乙腈-甲醇和乙酸铵、乙腈和乙酸-乙酸铵、甲醇-乙酸铵、甲醇和水等。有研究表明，在流动相中适当的加入甲酸（HCOOH）可增加化合物的ESI 离子化效率从而提高检测的灵敏度，克服样品分析中基质效应的干扰并拓宽化合物标准曲线的动态线性范围[12]。因此我们针对前三个流动相进行了优化和对比试验，结果发现在甲醇-乙酸铵流动相中，A 相2 mmol/L 乙酸铵中加入0.02 %的甲酸，同浓度的AFTB1响应值最高。AFTB1及13C17-AFTB1的MRM色谱图如图1。

2.2 质谱条件优化

采用ESI 正离子的多级检测模式，对MS 条件进行了优化，最终确定加热块温度为450 ℃，DL 温度为250 ℃，雾化气流速为3.0 L/min，干燥气流速为15 L/min，离子源接口电压+4.5，驻留时间为10 ms，在以上质谱条件下，对产物离子进行了自动优化，得到的MRM优化参数如表2。

2.3 线性范围

将AFTB1系列标准工作液按照1.3 中的分析条件进行测定，内标法定量。以AFTB1与13C17-AFTB1的峰面积比为纵坐标，浓度比为横坐标，绘制校准曲线，曲线方程为：Y=0.714338X-0.01059，校准曲线线性关系良好，如图2，r 值＞0.999；方法定量限为0.05 ng/mL，检出限＜0.01 ng/mL，均低于国标[13]检测方法。

表2 化合物信息和MRM参数

图2 AFTB1标准曲线

2.4 精密度试验

对浓度为1 ng/mL 和5 ng/mL 的标准工作液，分别连续测定6 次，考察仪器的精密度，峰面积的重复性结果如表3。结果显示，1 ng/mL、5 ng/mL标准品的浓度相对标准偏差（RSD%）分别为1.04 %和5.03%，仪器精密度良好。

表3 浓度重复性结果（n=6）

2.5 回收率试验

在酿酒原料及白酒中加入一定量的13C17-AFTB1同位素内标和AFTB1中间标准液（100 ng/mL），得到不同浓度的加标样品，再根据1.4 的方法进行样品的处理，测定其回收率如表4。酿酒原料高粱、大麦、小麦及白酒的回收率都在90 %～105 %之间，完全符合要求。

表4 回收率试验结果

3 结论

本研究采用三重四级杆液质联用仪建立了酿酒原料及白酒中AFTB1的检测方法。样品前处理相对简单，通过对比流动相选择：甲醇和0.02 %甲酸-2 mmol/L乙酸铵，仪器灵敏度最好，且降低了仪器检测限和方法定量限。该方法灵敏度高、重复性好，分析速度快，适合企业对酿酒原料和白酒中AFTB1的检测。

所绘制校准曲线线性关系良好，r 值＞0.999；方法定量限为0.05 μg/kg，检出限＜0.01 μg/kg，均低于其他检测方法。原料与白酒的加标回收率都在90%～105%之间，完全符合要求。