龙胆苦苷对非小细胞肺癌的炎症因子水平及上皮间质转化的影响

钟春蕾,黄国涛,杨洋,申思,张志强

（1.新乡医学院第一附属医院呼吸内科二病区，河南卫辉453100；2.新乡医学院第一附属医院心内科二病区，河南卫辉453100）

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是导致癌症死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌(non⁃small cell lung cancer,NSCLC)几乎占所有肺癌的80%[2]。由于转移,预后较差,治疗选择有限[3]。癌细胞转移是癌症死亡的主要原因,并且是涉及入侵和迁移的复杂的多步骤过程[4⁃5]。在许多情况下,晚期NSCLC患者预后不良和治疗失败是造成从原发部位到远处器官的局部浸润或转移的原因[6]。尽管在过去的几十年中早期诊断的改善和铂类化学疗法的发展,NSCLC患者的预后和存活率仍然不能令人满意,因此,迫切需要制定预防转移策略并寻找新的、安全有效的肺癌预防剂。长期以来,植物来源的天然产物一直被认为是抗癌剂的来源,并且正在针对几种类型的癌症进行评估。龙胆苦苷(gentiopicroside,GPS)是龙胆草的活性成分之一,据报道具有多种药理作用,包括抗炎[7]、保肝[8]和止痛[9]。最近,由于低毒的优势,GPS作为抗肝癌[10]和卵巢癌[11]的潜在抗癌剂受到越来越多的关注,但GPS对人类NSCLC是否具有抑制作用及其潜在机制尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

龙胆苦苷(gentiopicroside,GPS，美国Sigma);胎牛血清(FBS)、RPMI⁃1640培养基、胰酶(美国Invitrogen);TRIzol试剂(美国Thermo Fisher);CCK⁃8试剂盒、结晶紫、RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL发光液(上海碧云天);白细胞介素(interleukin,IL)⁃6、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和IL⁃1β ELISA试剂盒(武汉博士德);P65、p⁃P65、β⁃actin、E⁃cad、N⁃cad和Vimentin兔抗单克隆抗体、山羊抗兔IgG(Alexa Fluor®488)荧光二抗(美国CST公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆IgG抗体(英国Abcam);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore);tran⁃swell小室(美国康宁);基质胶(美国BD);高速低温离心机(美国Beckman公司);CO2培养箱、Nanodrop 2000(美国Thermo Fisher公司);流式细胞仪(美国BD Bio⁃sciences);倒置荧光显微镜(日本Olympus);凝胶成像系统(上海天能)。

1.2 细胞培养

人非小细胞肺癌A549细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),将细胞在含有10%(φ)胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的RP⁃MI 1640中于37℃、含5%(φ)CO2湿润条件下培养。

1.3 CCK8实验检测细胞活性

将A549细胞(每孔104个)接种到补充有10%FBS的100μL RPMI 1640中的96孔板中,并使其贴壁过夜。用不同浓度的GPS处理24 h后,将10μL CCK8溶液添加到平板的每个孔中。将板在37℃下孵育1 h,然后使用酶标仪测量450 nm处的吸光度（A）。所有实验一式三份进行,并重复至少3遍。

1.4 ELISA检测细胞上清液IL⁃6、iNOS和IL⁃1β的含量

将细胞(3×105/孔)铺在6孔板上培养过夜后,用0、5、10、20μmol/L浓度(分别用a、b、c、d表示)的GPS处理细胞24 h后,收集细胞并用超声仪裂解以制备细胞悬液。以1 000 g离心10 min后,取上清液按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清液中IL⁃6、i NOS和IL⁃1β的水平。

1.5 免疫印迹检测蛋白表达

将细胞(3×105/孔)铺在6孔板上培养过夜后,用0、5、10、20μmol/L浓度的GPS处理细胞48 h后,用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。用Nanodrop 2000测量蛋白质浓度并调平后,用十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE)分离蛋白质,然后将其转移到PVDF膜上。接下来,将膜用含有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭2 h。然后,将膜与稀释的一抗P65(1∶1 000)、p⁃P65(1∶1 000)、β⁃actin(1∶2 000)、E⁃cad(1∶1 000)、N⁃cad(1∶1 000)和Vimentin(1∶1 000)4℃孵育过夜。TBST洗涤3次,并与HRP偶联的二抗37℃孵育1 h。使用ECL并用quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。

1.6 Transwell分析检测细胞侵袭

上部Transwell室中预涂稀释的基质胶(BD),下部Transwell室添加0.5 mL含20%FBS的RPMI⁃1640培养基。将细胞用RPMI⁃1640培养基以5×105细胞/mL的密度悬浮,基质胶凝结后,然后将细胞悬液的等分试样100μL接种到上部Transwell室。培养20 h后,将通过膜的细胞用甲醇和0.05%结晶紫染色。使用光学显微镜从5个随机视野中确定侵袭细胞的数量。

1.7 免疫荧光检测Vimentin阳性细胞

将A549细胞以5×104个细胞密度接种在96孔板中,用0、5、10、20μmol/L浓度的GPS培养48 h后,用PBS洗涤,将细胞与兔抗Vimentin单克隆抗体(1∶100)4℃孵育30 min,PBS洗涤3次,加入山羊抗兔荧光二抗避光孵育15 min。荧光显微镜下观察Vimentin阳性细胞(绿色荧光)并拍照统计。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 龙胆苦苷对NSCLC细胞活力的影响

如图1所示,GPS对非小细胞肺癌A549细胞的活力有抑制作用,随着GPS浓度的升高,A549细胞存活率逐渐降低。选择0、5、10、20μmol/L浓度的GPS进行后续实验。

2.2 龙胆苦苷对NSCLC细胞炎症因子分泌的影响

如图2所示,与GPS 0μmol/L组相比,GPS10μmol/L和20μmol/L组A549细胞上清液中炎症因子IL⁃6、iNOS和IL⁃1β水平显著下降(P＜0.05),GPS 5μmol/L组差异无统计学意义。

2.3 龙胆苦苷对NSCLC细胞中NF⁃κBP65磷酸化的影响

图1 GPS对NSCLC细胞活力的影响Figure 1 Effect of GPS on the viability of non⁃small cell lung cancer cells(±s,n=5)

如图3示,与GPS 0μmol/L组比较,GPS 10μmol/L和20μmol/L组A549细胞中NF⁃κB P65磷酸化水平显著降低(P＜0.05),GPS 5μmol/L组差异无统计学意义。

2.4 龙胆苦苷对NSCLC细胞侵袭能力的影响

如图4示,与GPS 0μmol/L组比较,GPS10μmol/L和20μmol/L组A549细胞侵袭细胞数目明显减少(P＜0.05),GPS 5μmol/L组差异无统计学意义。

2.5 龙胆苦苷对NSCLC细胞EMT的影响

如图5所示,与GPS 0μmol/L组比较,GPS10 μmol/L和20μmol/L组A549细胞中N⁃cad和Vimen⁃tin的蛋白表达显著下调(P＜0.05),E⁃cad蛋白表达显著上调(P＜0.05);免疫荧光染色结果示GPS 10μmol/L和20μmol/L组Vimentin阳性细胞数目明显减少,GPS 5μmol/L组差异无统计学意义。

图2 GPS对NSCLC细胞炎症因子分泌的影响Figure 2 Effect of GPS on the secretion of inflammatory factors in non⁃small cell lung cancer cells(±s,n=5)

图3 GPS对NSCLC细胞中NF⁃κB P65磷酸化的影响Figure 3 Effect of GPS on NF⁃κB P65 phosphorylation in non⁃small cell lung cancer cells(±s,n=5)

图4 GPS对NSCLC细胞侵袭能力的影响Figure 4 Effect of GPS on the invasion ability of non⁃small cell lung cancer cells(±s,n=5)

图5 GPS对NSCLC细胞EMT标记物蛋白表达的影响Figure 5 Effect of GPS on the expression of EMT marker protein in non⁃small cell lung cancer cells(±s,n=5)

3 讨论

肺癌的侵袭和转移是导致癌症治疗失败和晚期NSCLC预后不良的主要因素,也是其高死亡率的原因[12⁃13]。因此,发现新的抗转移剂对于肺癌的治疗至关重要。最近,大量证据表明许多基于天然产物的药物因其对多种疾病,特别是对肿瘤转移的有益作用而受到了更多关注。GPS是一种重要的植物次生代谢产物,已显示出抗癌作用[10⁃11,14]。CCK8实验表明,与对照比较,GPS10μmol/L及以上浓度时,A549细胞的存活率显著降低,所以GPS对A549细胞具有毒性作用。

研究发现,炎症微环境能通过多种细胞因子来促进肿瘤的发生、发展,参与肿瘤的转移等[15⁃16]。IL⁃6是诱导上皮间质转化(epithelial⁃to⁃mesenchymal transition,EMT)和NSCLC肿瘤转移的重要细胞因子[17⁃18]。IL⁃6的增加可导致肺癌分子靶向治疗的耐药性[19],IL⁃6水平可能是NSCLC患者的预后指标[20]。IL⁃1β在肿瘤微环境中起着双向作用,微量IL⁃1β可促发适当的免疫应答而激活特异性免疫反应而起免疫监控效应,大量IL⁃1β可能导致炎性损伤[21]。本研究结果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明显降低A549细胞中IL⁃6、IL⁃1β和iNOS的产生,减轻肿瘤微环境的炎症浸润。iNOS被认为与NSCLC的发生明显相关,研究发现NSCLC患者肿瘤组织中iNOS的表达显著增高,且与术后生存期及淋巴结转移密切相关[22]。NF⁃κB被认为是免疫和炎症反应的主要介质,且IL⁃6可能会增强NF⁃κB信号通路的激活[23]。本研究结果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)明显降低NF⁃κB P65的磷酸化水平,抑制NF⁃κB通路的激活。

EMT被认为是癌症恶性、转移和复发中最关键的步骤之一[24]。为了进一步检测GPS的潜在抗转移作用,对A549细胞进行了侵袭实验和EMT蛋白表达的检测。在EMT进展过程中,癌细胞会获得间质特征,例如波形蛋白和N⁃钙黏着蛋白的增加,并失去上皮特性,例如E⁃钙黏着蛋白的减少[25]。本研究中,GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明显减少A549细胞的侵袭数目,并通过降低N⁃钙粘蛋白和波形蛋白的表达来显著抑制EMT进展,同时增加E⁃钙粘蛋白的蛋白表达,这表明GPS抑制了A549细胞的EMT。

综上所述,本研究结果表明GPS可以有效抑制A549细胞的侵袭和转移,其主要机制可能是炎症因子IL⁃6和NF⁃κB P65的磷酸化水平降低所致。因此,GPS可能会成为将来治疗或预防肺癌的有效抗肿瘤药物。