SIRT1、P16和Ki67与HPV感染交互作用在宫颈病变中的应用分析

王兴民,庞朗,刘斌,吕健勇,傅锦坚

（柳州市妇幼保健院1.病理科；2.预防保健科，广西柳州545001）

宫颈癌是全球范围内女性人群中排行第4位的常见恶性肿瘤,人乳头瘤病毒(HPV)的感染是常见的致病因素之一[1]。某些HPV类型,尤其是高危HPV(HR⁃HPV)16和18,可能导致子宫颈的持续感染,引起不可逆的变化,导致原位癌,最终向浸润性子宫颈癌发展[2]。目前筛查宫颈癌的主要手段是宫颈细胞学和HPV检测相结合的方法,但由于两种检测手段的特异性不高,且因为细胞学检查的敏感性相对较低,许多HPV阳性者需要重复进行细胞学随访。因此,临床上需要更有效的标记物以对细胞学正常但HPV DNA检测阳性者进行进一步的筛选,以期早期鉴定出有宫颈病变的妇女。已有研究显示,沉默信息调节因子1(SIRT1)是NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶,属于Sirtuin家族,其SIRT1与子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌和子宫颈癌等女性生殖器官肿瘤的发生发展关系密切[3⁃6]。而P16/Ki⁃67双染色细胞学正在成为一种替代的生物标志物,显示出总体的高度敏感性和特异性,可用于鉴定高级的宫颈病变[7]。因此本研究通过检测HPV DNA、SIRT1、P16和Ki67,以阐明上述因子在宫颈病变进展中的检出阳性率和病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年1月-2018年12月在我院经手术治疗或宫颈活检的116名患者作为研究对象。研究对象入组前,由临床医师询问研究对象并填写《知情同意书》方可入组。本研究经柳州市妇幼保健院伦理委员会批准,批准号20140013。

1.2 病理诊断与分组

病理医师对临床医师送检的宫颈组织进行诊断,并结合免疫组化P16、Ki⁃67检测情况分组将研究对象分为5组:炎症组、低级别上皮内瘤变(LSIL)、高级别上皮内瘤变(HSIL)和宫颈鳞癌组。宫颈上皮病变细胞学的诊断标准按照文献提及的方法进行[8],宫颈病变组织学的诊断标准按(2014年女性生殖器官肿瘤WHO分类)列明的要求进行[9]。排除有合并其他癌症病变者、心肾功能不全者和进行放化疗手术者。经诊断标准和排除标准后,共纳入宫颈炎患者20人、LSIL32人、HSIL44人和宫颈鳞癌20人。

1.3 HPV DNA检测方法

根据我院遗传优生科报道的检测方法[10],对116名研究对象的宫颈细胞样本进行HPV DNA检测,阳性者统一标注为阳性。

1.4 免疫组化检测SIRT1、P16和Ki67

免疫组化染色使用罗氏免疫组化仪(Benmark XT);SIRT1的检测方法参照本室报道[11]的方法进行,抗体购自ABcam公司的SIRT1羊抗人抗体;P16和Ki⁃67的免疫组化检测方法参照文献提及的方法[8]进行,试剂分别购自福建迈新生物公司和罗氏生物公司。

1.5 数据统计分析

采用IBM23.0软件、SPSS18.0软件进行统计分析。采用χ2检验/确切概率法分析4种因子的表达情况,logistic回归模型分析肿瘤蛋白标志物与HPV感染交互作用在宫颈病变发展中的发病风险。

2 结果

2.1 研究对象的基本特征

纳入的116名研究对象年龄21～68岁,平均年龄(38.5±5.1)岁。宫颈炎组、LSIL组、HSIL组和宫颈鳞癌组研究对象的年龄分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 不同程度宫颈病变患者HPV检出率和SIRT1、P16和Ki67表达阳性率

SIRT1在宫颈炎、LSIL、HSIL和宫颈癌患者组织的阳性率分别为40.0%、68.8%、68.2%和100.0%;P16在宫颈炎症、LSIL、HSIL和宫颈癌患者组织的阳性率分别为0.0%、43.8%、95.5%和100.0%;Ki67在宫颈炎症、LSIL、HSIL和宫颈癌患者组织的阳性指数分别为0.0%、87.5%、100.0%和100.0%。HPV的检出率在宫颈炎症、LSIL、HSIL和宫颈癌患者组织的检出率分别为10.0%、68.8%、50.0%和70.0%。结果提示随着疾病的发生进展,HPV阳性检出率、SIRT1、P16和Ki67肿瘤蛋白标志物的阳性率逐渐增高(所有P值均＜0.01),见表1。

2.3 病毒⁃肿瘤蛋白交互作用在宫颈上皮内瘤变恶化过程中的作用

Logistic回归模型显示HPV分别与SIRT1和Ki67存在病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用，导致LSIL向HSIL发展过程中的发病风险增加（P值分别为0.007、0.007）。SIRT1、P16和Ki67之间的交互作用也在宫颈上皮内瘤变恶化过程中发挥着重要作用（P值分别为0.001、＜0.001和＜0.001），见表2。

2.4 病毒⁃肿瘤蛋白交互作用在HSIL向宫颈癌恶化过程中的作用

Logistic回归模型分析HPV与SIRT1、P16和Ki67的病毒⁃肿瘤蛋白表达交互作用，以及蛋白⁃蛋白交互作用，结果显示SIRT1⁃HPV和HPV⁃Ki67的病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用是HSIL向子宫颈鳞状细胞癌发生发展的重要危险因素（P值均为0.045），见表3。

表1 宫颈病变患者HPV检出率和SIRT1、P16和Ki67表达阳性率Table 1 Positive rate of HPV and expression of SIRT1,P16 and Ki67in women with cervical lesions[n(%)]

表2 宫颈上皮内瘤变恶化过程中病毒⁃肿瘤蛋白交互作用Table 2 Interactions of virus⁃tumor protein expression in the progression of cervical intraepithelial neoplasia

表3 HSIL向宫颈癌恶化过程中病毒⁃肿瘤蛋白交互作用Table 3 Interactions of virus⁃tumor protein expression in the progression of HSIL to cervical cancer

3 讨论

宫颈癌是常见的妇科生殖道恶性肿瘤，从宫颈病变到宫颈癌的发生发展是多因素综合的结果，其中研究较多的是HPV感染。HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的主要原因之一，因而目前已有大量的研究将检测HPV DNA作为宫颈癌的筛查工具之一［12］。本研究结果显示，HPV DNA的阳性检出率从慢性宫颈炎的10%上升到宫颈癌的70%，随着宫颈病变的程度增加，HPV阳性检出率增加，表明HPV的感染与宫颈癌的发生发展密切相关。有研究表明，在宫颈上皮内瘤变（CIN）II～III和宫颈癌患者中，HPV感染率可达到92.9%和96.5%［13］，这证实了HPV感染的严重程度与宫颈病变程度高度相关。

但也有研究报道，有些患者HPV感染仅为一过性的，有些HPV感染却呈进展性恶化，研究者发现从宫颈炎症到低级别上皮内瘤变再进展至高级别上皮内瘤病变甚至是宫颈癌变过程中，HPV的持续感染亦发生了一些转变，包括了将病毒附加体整合到宿主细胞基因组中，以及两种病毒癌蛋白HPV E6和HPV E7的表达增强［14］。此外，一些能够调控HPV病毒癌蛋白表达的基因，也被证明在宫颈病变的发生发展进程中发挥着重要的作用，其中研究较多的是SIRT1。

SIRT1是HPV16 DNA复制复合体的一部分，并由HPV病毒蛋白E1和E2带入病毒基因组［15］。另HPV E7选择性诱导SIRT1蛋白水平升高，在通过整合的HPV病毒基因组自然表达HPV E7的SiHa细胞中，沉默E7可导致SIRT1蛋白减少［16］。上述研究情况显示HPV E7可正调控SIRT1蛋白水平；亦即HPV病毒和SIRT1之间存在交互作用。本研究结果亦表明，随着宫颈病变发生发展，除了HPV DNA阳性检出率增加外，SIRT1蛋白表达阳性率和阳性水平均增加，且SIRT1⁃HPV的交互作用不仅仅存在于从LSIL到HSIL恶化进程，也存在于HSIL转变为宫颈癌的进程中，提示SIRT1与HPV病毒在宫颈病变发生发展中起着重要作用。

P16是一种肿瘤抑制因子，可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6，从而阻止正常细胞进入细胞周期的S期。当宫颈细胞通过HR HPV感染转化时，HPV病毒致癌蛋白E6和E7失调，可诱导视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白的功能失活［17］。Rb蛋白失活后，转录因子E2F释放，导致P16在宫颈细胞核和细胞质中过表达［17］。因此P16的过度表达可以提示癌前宫颈病变和宫颈癌。一项荟萃分析结果显示，宫颈病变程度由轻度向重度发展时，P16阳性表达率在CINI、CINII和CINIII中可分别达到38%、68%和82%［18］。上述的机制也许可以解释宫颈细胞从LSIL到HSIL过程中P16和HPV之间存在交互作用，可导致宫颈上皮内瘤变恶化。与本研究结果相似，HPV16和/或18型DNA负荷与P16/Ki⁃67染色的结合提高了CINI和CINII病变检测的敏感性［19］，表明联合HPV DNA与P16免疫组化检测，可提高宫颈病变恶化程度检测的准确率。

Ki67细胞增殖抗原已在某些研究中提及，由于Ki67在增生性病变中的表达增加，因此被研究者推荐作为评估肿瘤进展的标志物之一［20］。该研究提示，在HPV DNA阳性的宫颈上皮内瘤变中，Ki67的免疫阳性反应代表了病变细胞的增殖活性。这种抗原在识别CIN邻近的病变时具有实用性，因为病理工作者可根据Ki67的表达程度，将宫颈上皮内瘤变与良性病变（例如萎缩性鳞状上皮、未成熟的鳞状化生或过渡上皮）中的低表达区分开来。上述研究结果提示了Ki67的表达程度与HPV DNA阳性检出率具有相关性，且随着疾病病变程度增加而增加。在本项研究中，随着疾病的发生进展，Ki67的阳性指数逐渐增高，且Ki67表达水平随着宫颈病变程度加重而相应增加，这与已有研究结果相似，该研究结果表明，在组织病理学诊断中，发现Ki67表达阳性率与HSIL的相关性更高，达到80%［20］。

基于上述的HPV检测与Ki67和P16免疫组织化学检测的结合，本研究发现HPV分别与SIRT1和Ki67存在病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用的患者可被确定为HSIL发病的高危病例，此外宫颈样本中检出SIRT1⁃HPV和HPV⁃Ki67的病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用是宫颈癌发病的高危因素。上述情况显示HPV DNA阳性、P16、Ki67表达、以及病毒⁃肿瘤蛋白表达的交互作用与宫颈病变的严重程度有关，临床工作者可通过宫颈病变的组织病理学诊断和宫颈样本的HPV检测结果，用于预测宫颈病变进展、根据检测结果进行早期干预或确定随访策略的有用生物标志物。