深度创伤后瘢痕发生发展机制及干细胞来源的外泌体治疗研究进展

林宇建，韩兵，麦钰仪，时军,3*

（1.广东药科大学中药学院，广东广州510006；2.中国医学科学院整形外科医院整形九科,北京100144；3.广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心，广东广州510006）

外科手术、严重烧烫伤或皮肤穿刺等伤及真皮层的深度创伤时，皮肤易产生增生性瘢痕（hypertrophic scars，HS）。增生性瘢痕是病理性创面愈合的象征，也是机体严重组织损伤修复的必然产物[1]。增生性瘢痕临床症状表现为不规则隆起、充血呈现红色、质地坚韧的斑块，会引起疼痛、瘙痒和挛缩[2]。增生性瘢痕发病率较高，研究显示烧伤后发病率为44%[3]，手术创伤后发病率超70%[4]，已经成为影响人们生活质量的重大问题。增生性瘢痕严重者、会导致关节的功能障碍，给患者带来了生理的痛苦，还会因外观形象受损给患者心理和社交带来沉重的负担。

瘢痕的防治已成为医学研究的热点。目前研究认为,增生性瘢痕病理机制与成纤维细胞过度增殖、细胞因子分泌失调和信号通路异常密切相关。瘢痕的治疗目前主要有手术治疗，瘢痕内药物注射治疗、激光治疗、放射治疗、外用药物治疗、有机硅凝胶制品应用、加压治疗及物理康复综合治疗等，这些方法取得了一定的疗效，但也存在各自的不足，因此至今缺乏增生性瘢痕的理想治疗方法[5]。外泌体作为一种由细胞分泌的纳米囊泡，广泛参与细胞之间的交流，发挥生物学效应，在机体的生理和病理过程中扮演着重要角色。研究发现间充质干细胞来源外泌体通过转运多种生物活性成分（特异性蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等）进入靶细胞，调控创面修复过程的多个环节，促进创面愈合和抑制瘢痕形成，对增生性瘢痕防治有可观的应用前景[6]。

1 皮肤深度创伤的修复过程

皮肤深度创伤修复是一个复杂和动态的过程，一般可分为止血、炎症反应、细胞增殖分化和组织重塑、瘢痕形成阶段。这4个不同但重叠的阶段受到各种细胞生长因子的高度调控[7]。

1.1 止血阶段

皮肤受创后血管收缩，血管内膜损伤激活血小板和血浆中的凝血系统，导致血小板聚集成团和出现纤维蛋白血凝块，并共同构成止血栓，有效止血。同时血小板释放多种生长因子(包括血小板衍生因子PDGF、血管内皮生长因子VEGF)，刺激内皮扩散、迁移和管型形成。巨噬细胞和单核细胞释放白细胞介素⁃8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子⁃α(TNF⁃α)等，在伤口部位被激活表达各种黏附分子，从而进一步促进伤口止血[8]。

1.2 炎症反应阶段

炎症反应早期是由于纤维蛋白凝块和血小板脱颗粒释放趋化因子，导致大量中性粒细胞迁移至创面区域；形成中性粒细胞胞外诱捕网，抵御病原体的入侵[9]。后期巨噬细胞逐渐增多，在其中发挥核心作用。巨噬细胞分两型[10]：M1型巨噬细胞具有杀灭病原体的功能；M2型巨噬细胞具有修复组织的功能。不同的刺激可使巨噬细胞极化，它的极化是基于T细胞亚群Th1和Th2分泌的细胞因子联合外源性诱导的结果。前期Th1分泌的IFN⁃γ刺激下，巨噬细胞激激活为M1型巨噬细胞，可清除细菌、清除组织碎片，同时分泌TNF⁃α、IL⁃1、IL⁃6等炎症因子，促进炎症反应。Th2细胞因子(如IL⁃4、IL⁃13)则使巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，分泌表皮生长因子、血管内皮生长因子等从而促进诱导细胞外基质合成、表皮细胞再生及新血管形成[11]。

1.3 细胞增殖分化阶段

在细胞增殖分化阶段，由炎症反应阶段末期的炎症细胞和上皮细胞，真皮细胞分泌大量的细胞因子包括：转化生长因子⁃β1（TGF⁃β1）、血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等诱导了血管生成、成纤维细胞的迁移和增殖分化。促进了细胞外基质形成了富含新生血管的肉芽组织，并逐渐上皮化[12]。

1.4 组织重建、瘢痕形成阶段

组织的重建由新形成的肉芽组织为主体，在此阶段成纤维细胞和成肌纤维细胞形成暂时性的细胞外基质，主要为胶原蛋白形式，还有纤维蛋白、透明质酸和蛋白聚糖等。含有肌动蛋白丝的肌成纤维细胞具有收缩特性，并随着时间的推移有助于使伤口边缘聚集在一起。随后过量的细胞外基质的主要成分胶原蛋白III会降解并重塑为成熟的胶原蛋白I，最后形成与正常皮肤组织张力相仿的无细胞瘢痕组织[13]。

2 增生性瘢痕的发生发展分子机制

增生性瘢痕形成基础是创伤修复过程中成纤维细胞变质异型化而过多增殖，以胶原为主的细胞外基质成分大量沉积[14]。增生性瘢痕目前研究认为是生长因子和信号通路等多种因素共同参与形成，如图1所示。增生性瘢痕的分子信号通路的研究，有助于进一步阐明增生性瘢痕的发病机制，为药物防治增生性瘢痕提供理论依据。

2.1 TGF⁃β1/Smads信号通路

TGF⁃β最初从血小板中分离获得，可促进成纤维细胞的转化生成，参与伤口愈合的全过程，是目前已知与增生性瘢痕关系最密切的细胞因子[15]。

TGF⁃β1/Smads信号通路是目前公认的瘢痕形成机制中的主要信号转导通路。Smads蛋白家族是细胞内信号转导蛋白，位于TGF⁃β1/Smads信号通路中TGF⁃β1的下游，介导TGF⁃β1信号在细胞内传导。当机体受创时，TGF⁃β1先与TGF⁃β受体2（TGFR2）结合，然后募集并激活TGFR1。TGFR1活化后使Smad2和Smad3磷酸化，后者与Smad4结合并转运至细胞核，并促进目的基因在核内转录，导致成肌纤维细胞的激活和细胞外基质的沉积。同时Smad6和Smad7可拮抗Smad2/3的磷酸化，抑制TGF⁃β家族的信号转导，起到负反馈调节作用[16]。

现今有不少研究通过抑制TGF⁃β1/Smads信号通路来减少纤维化，有研究[17]使用脉冲染料激光调节TGF⁃β1/Smad3信号通路，促进成纤维细胞凋亡并改善了瘢痕增生。周忠志等[18]发现积雪草苷通过通路调节胶原纤维及TGF⁃β1表达，减少兔耳增生性瘢痕组织。在褪黑素在糖尿病性心肌病的模型中发现，褪黑激素的给药通过抑制TGF⁃β1/Smads信号转导，产生抗纤维化作用并减少了胶原蛋白的产生，显著改善了心脏功能障碍[19]。表明TGF⁃β1/Smads信号通路在抗纤维化和增生性瘢痕机制上有重要作用，可以成为防治增生性瘢痕的突破口。

图1 增生性瘢痕形成机制Figure 1 Mechanism of hypertrophic scar formation

2.2 MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(m itogen⁃activated protein kinase，M APK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，在细胞外刺激下通过MAPK级联反应，将信号转导至胞内及核内而影响细胞增殖、发育、老化及凋亡等生物学反应[20]。MAPK起着枢纽作用，目前研究认为细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和p38信号通路受到抑制或过度激活会导致伤口延迟愈合或瘢痕形成。

ERK广泛存在于各种组织，参与细胞的增殖分化的调控。胡瑜[21]研究表明ERK1/2蛋白信号在新生鼠肺纤维化中，是调控成纤维细胞增殖，转化及迁移的重要转导信号。有研究发现在成纤维细胞增殖过程中ERK1/2活性异常[22]，而另一项研究结果表明，表儿茶素能降低成纤维细胞中活性ERK1/2的蛋白表达，抑制了成纤维细胞增殖[23]。此外，有研究通过A型肉毒毒素来抑制ERK/MAPK信号通路而使得成纤维细胞凋亡增加，Ⅰ型胶原蛋白分泌减少[24]。表明增生性瘢痕的发生机制与ERK1/2MAPK信号通路密切相关。

P38/MAPK是真皮成纤维细胞中胶原蛋白合成的正向调节剂，也是TGF⁃β1的介质，可刺激细胞外基质的产生。在p38/MAPK抑制剂作用下，会导致α⁃SMA和TGF⁃β1的诱导作用降低。Shuo等人发现roscovitine通过抑制糖尿病小鼠的TGF⁃β1/p38MAPK途径，达到抗纤维化作用，对糖尿病肾纤维化有保护作用[25]。有实验通过p38 MAPK和ERK1/2抑制剂缓解了纳米NiO诱导的细胞胶原形成以及MMPs/TIMPs失衡，提示MAPK通路在胶原形成中有着重要作用[26]。此外有研究显示脂肪组织干细胞可通过p38/MAPK途径，降低胶原蛋白的表达[27]。

2.3 Wnt/β⁃catenin信号通路

Wnt/β⁃catenin信号通路是一条高度保守的信号途径，调控着胚胎发育以及成年人体内细胞生长、迁移、分化的平衡，被认为是皮肤伤口愈合的重要途径[28]。创伤等诱因激活Wnt通路，Wnt蛋白与细胞膜上Frizzled受体结合，经过细胞内一系列反应。β⁃catenin的降解被抑制，进而转位至细胞核中，激活Wnt靶基因的转录表达[29]。

β⁃catenin异常可导致纤维组织过多和瘢痕形成。有研究[30]发现在Wnt/β⁃catenin信号中响应的lncRNA，影响了纤维化的关键标志物的表达，增强了胶原的收缩，表明可能与调节真皮成纤维细胞的行为和真皮纤维化中胶原的积累有关。还有报道通过局部应用小分子Wnt抑制剂对Wnt/β⁃catenin信号通路抑制，可以减少瘢痕并促进再生性皮肤伤口修复[31]。表明Wnt/β⁃catenin信号通路是影响瘢痕形成的重要机制。Wnt/β⁃catenin信号转导通路还与TGF⁃β/Smads信号转导通路相互调节作用形成瘢痕。既发现真皮成纤维细胞表型转化中，TGF⁃β1可能通过上调Wnt配体分子，激活Wnt/β⁃catenin信号通路，直接在蛋白水平活化β又发现外源活化Wnt/β⁃catenin可以抑制TGF⁃β1诱导的真皮成纤维细胞表型转化，对TGF⁃β1诱导的成纤维细胞表型转化起负反馈调控作用[32]。提示Wnt/β⁃catenin信号转导通路通过影响TGF⁃β1参与增生性瘢痕的发生。

2.4 PI3K/AKT信号传导通路

PI3K属于一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v⁃src和v⁃ras等癌基因的产物相关，且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。AKT是一种丝苏蛋白激酶，参与多种细胞生命活动，作为PI3K最重要的下游激酶，在调节细胞的增殖、凋亡与分化等生理过程中发挥重要作用。

有研究三七皂苷Ft1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖，并促进了遗传性糖尿病小鼠的伤口愈合[33]。同样，在博莱霉素诱导的肺纤维化的模型中，PI3K/AKT被激活导致肺成纤维细胞增殖，而PI3K抑制剂治疗可减少成纤维细胞增殖并改善肺功能[34]，表明PI3K⁃Akt通路与成纤维细胞增殖分化密切相关。随着miRNA调控基因表达的作用被发掘，越来越多的人关注miRNA对瘢痕通路的关系。有研究发现miRNA⁃155通过PI3K/AKT途径靶向缺氧诱导因子⁃1α，可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的形成[35]。还有He等报道miRNA⁃494可靶向PTEN，抑制PI3K/AKT途径以减轻增生性瘢痕的形成[36]。

3 外泌体防治增生性瘢痕

外泌体(exosomes)是细胞内多囊泡体与细胞膜融合后分泌至细胞外环境的纳米囊泡，参与细胞间通信，细胞增殖，细胞迁移和免疫调节等过程，在机体的生理和病理过程中发挥极其重要的作用[37]。现在已经成功从多种类型的细胞培养上清液中提取分离出了外泌体，如神经元细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞等[38]。

外泌体具有易于体外扩增、低排斥反应和良好的靶向性等优势，是近年来兴起的一种极具发展潜力的生物技术产品，在皮肤组织再生中具有显著的临床应用前景。多种干细胞外泌体可预防损伤后皮肤组织过度增生和瘢痕形成，研究发现人脐带间质干细胞外泌体（huc⁃MScs Exo）能够加快深Ⅱ度烫伤皮肤愈合，预防损伤后皮肤过度增生和瘢痕形成。2018年4月，FDA批准了Aegle Therapeutics公司首个EV新药AGLE⁃102的申请，用于烧伤和大疱性表皮松解症患者的治疗，目前正在进行临床试验。

外泌体富含特殊的生物分子、功能蛋白和核酸，包括miRNAs、mRNAs，甚至DNA[39]。受体细胞可以通过膜融合、胞吞作用或者细胞特异性的吞噬作用摄入外泌体[40]。其中间充质干细胞旁分泌的外泌体，具有来源细胞特性，通过基因转录，向靶细胞投递蛋白、mRNA、mi RNA等信号分子，通过调节炎症、促进细胞增殖、血管再生及抑制瘢痕形成等多途径在皮肤创伤修复中起到关键作用，如图2所示。

3.1 调控炎症发展

皮肤组织受损之后，身体会做出自我防御机制，引起炎症反应，同时也伴随着炎性因子分泌的变化。良好的炎症反应会有助于创伤的恢复，但是过度的炎症反应可能皮肤会形成增生性瘢痕，损害器官功能。据研究发现，干细胞来源的外泌体可以抑制由热应激引起的炎症反应，能调节免疫细胞中各种炎症因子的分泌如抑制肿瘤坏 死 因 子（TNF⁃α）、白 细 胞 介 素IL⁃1β、干 扰 素γ（IFN⁃γ）、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等的表达，促进抗炎因子IL⁃10的表达[41]。此外有研究巨噬细胞来源的外泌体在糖尿病大鼠模型中，可抑制促炎酶和细胞因子的分泌发挥抗炎作用，并加速伤口愈合，为糖尿病创伤修复开拓了新的治疗方向[42]。

图2 外泌体修复皮肤的作用机制Figure 2 Function mechanism of exosome repair of skin

3.2 调控成纤维细胞增殖

细胞增殖是创面修复的关键环节，外泌体能够在其中积极发挥调控作用。有研究发现在大鼠皮肤烧伤模型中人脐带间充质干细胞来源（human umbilical cord mesen⁃chymal stem cells,hucMSCs）的外泌体可以以剂量依赖的方式促进真皮成纤维细胞的增殖、迁移，促进创面愈合。在受到体外热应激后，hucMSC外泌体可激活AKT通路，减少热应激诱导的皮肤细胞凋亡。另外还发现，hucMSC外泌体中的Wnt4可激活β⁃catenin通路，促进细胞核抗原、细胞周期蛋白D3、N钙黏素和I型胶原的表达增加，增强成纤维细胞的增殖[43⁃44]。王晓[45]发现胎儿真皮间充质干细胞外泌体(FD MSC⁃Exo)有增强成人真皮成纤维细胞的增殖、迁移、合成ECM的能力，可以促进小鼠背部皮肤创面愈合。同样在人羊膜间充质干细胞外泌体（hAMSC⁃Exo）的划痕实验中发现过表达miR⁃135a后，hAMSC⁃Exo促进成纤维细胞迁移能力增强，而敲减miR⁃135a后促进成纤维细胞迁移能力减弱，表明hAMSC⁃Exo中的miR⁃135a对促进成纤维细胞迁移起关键作用[46]。

3.3 促进血管再生

血管新生能够为组织和器官提供足够养分，对修复创面有着重要的作用。间充质干细胞对促进血管生成中的作用机制仍未明确，但其外泌体可能是这环节中的重要参与者。相关研究表明干细胞来源的外泌体可直接被内皮细胞摄取，或可间接上调血管生成相关的生长因子、细胞因子等的表达水平作用于内皮细胞，提升内皮细胞增殖并迁移到伤口区域的能力，促进血管形成[47]。

外泌体中富含的各种miRNA对促进血管再生有重要作用。Liang等发现人脂肪间充质干细胞源的外泌体有促进血管的形成的作用，其中的mi R⁃125a可以促进血管形成及相关标记物的表达[48]。miR⁃125a敲除后，该外泌体成血管活性被抑制。人尿液干细胞源性外泌体可以加速大鼠皮肤创伤的血管新生，促进修复与再生[49]。此外,mi RNA⁃6087可调控内皮细胞的分化，经血源性子宫内膜干细胞中外泌体含有的miRNA⁃21可调节血管生成[50⁃51]。

3.4 抑制瘢痕形成

细胞外基质的沉积是增生性瘢痕形成的重要因素。而外泌体可以调控细胞外基质，从而抑制瘢痕形成。在体外实验中，外泌体激活了皮肤成纤维细胞中的细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路，使得基质金属蛋白酶⁃3(MMP3)的水平增加，从而增加MMP3与组织基质金属蛋白酶抑制剂⁃1(TIMP1)的相对比例，进而促使细胞外基质的重塑。

hucMSCs外泌体不仅可以作为加快修复受损的皮肤组织，在高细胞密度情况下，外泌体源的蛋白质14⁃3⁃3ζ通过诱导YAP磷酸化抑制Wnt/β⁃catenin信号传导，抑制胶原蛋白沉积，减少细胞外基质过度增生[52]。在hucMSCs外泌体在小鼠背部皮肤全层创面缺损模型中，外泌体中富 含miRNA⁃23a、miRNA⁃21等miRNAs，阻 断TGF⁃β/Smad2信号通路，抑制瘢痕形成[53]。

深度创伤后创面易过度修复，在生长因子和信号通路等因素共同诱导成纤维细胞增殖和细胞外基质大量沉积，导致增生性瘢痕形成，给患者带来许多困扰。而外泌体具有储存稳定、高效向伤口富集而且富含多种蛋白质和miRNA，可以调节炎症发展、调控细胞增殖、促进血管再生等方面发挥重要作用，发挥促进创面愈合与抑制瘢痕形成的双重功效等优势，具有良好的组织再生修复潜力。仿生型药物递送系统以天然微粒载体为基础，具有良好的靶向性和低免疫原性，是近年来兴起的一种极具发展潜力的药物递送系统。外泌体可作为一种仿生型药物递送系统，包载抑瘢药物，有望实现瘢痕根治。尽管外泌体在增生性瘢痕防治方面取得了一定的成就，但仍存在诸多问题，如研究方法的标准化、作用机制的明确及应用的有效性等。加强外泌体的基础和转化研究，对增生性瘢痕的早期诊断及有效治疗具有重要的意义。