柚皮苷二氢查尔酮的抗氧化活性研究

彭 颖，何婉莺，范 鑫，卢 琪，何小燕，潘思轶*

（1 华中农业大学食品科技学院 武汉430070 2 安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌443003）

1963年，俞福惠等[1]发现二氢查尔酮及其衍生物可作为甜味剂，并从柑橘黄烷酮中提取了柚皮苷二氢查尔酮（Naringin DC）等。二氢查尔酮的甜味持续时间长，口感清爽，甜度高，热量低，安全无毒，能有效的屏蔽苦味[2]。二氢查尔酮类化合物对糖尿病有一定作用。此外，二氢查尔酮类化合物具有药效基团-2，6-二羟基苯乙酮结构，该基团有抗氧化作用，通过消除过氧化物、清除羟自由基来实现[3]。欧阳振宇[4]以柚皮渣为原料，超声波辅助提取柚皮苷，并用D101 大孔树脂分离富集，得到纯度为83.7 %的柚皮苷；对柚皮苷在碱性条件下加压并以钯碳作为催化剂合成柚皮苷二氢查尔酮（Naringin DC），产率为85.2%。文献[5]和[6]以超声波辅助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷，并用弱极性AB-8 树脂分离纯化柚皮苷，NaOH 作为洗脱剂，得到纯度为77.26%的柚皮苷碱溶液，最后将该碱液在催化剂雷尼镍的作用下，加氢合成Naringin DC。李晚谊等[7]研究表明云南甜茶有强的过敏作用，其抗过敏作用的有效成分是二氢查尔酮-4’-β-D 葡萄糖苷和二氢查尔酮-2’-β-D 葡萄糖苷。方旭兵等[8]研究表明龙血树醇提取物龙血竭的主要成分——龙血素A 和龙血素B 均为二氢查尔酮类化合物，经对相关二氢查尔酮合成和修饰以及用HepG2 细胞进行抗肝癌肿瘤活性筛选，发现二氢查尔酮类化合物中F-18 和F-16 抗肝癌肿瘤活性较好。杨美琪[9]研究表明利用硅胶、大孔树脂、MCI-CHP20P 及葡聚糖凝胶柱等分离方法，结合薄层色谱及HPLC 分析木枣枣根醇提物，得到含量较高的二氢查尔酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖苷等16 个化合物[9]。目前，Naringin DC 的活性研究报道较少，本研究对其抗氧化活性和美白活性进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

柚皮苷标准品，上海源叶；Naringin DC 标准品，上海源叶；新橙皮苷二氢查尔酮标准品，上海源叶；ABTS，碧云天生物；酪氨酸酶，上海源叶；其它试剂均为分析纯；Autodock vina 1.1.2，美国Scripps 研究所。EL204-IC 分析天平，美国METTLER TOLEDO 公司；5 mL 移液枪，美国Eppendorf 公司；Synergy TX 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；Multiskan Go 全波长读数仪，美国Thermo Scientific 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ABTS 自由基清除能力测定 通过3.0 mg/mL 柚皮苷、1.0 mg/mL Naringin DC、0.30 mg/mL NHDC、0.0025 mg/mL 槲皮素与ABTS 自由基反应，测定其吸光值，绘制Trolox（0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mmol/L）标准曲线，计算其与Trolox 的相同清除能力时的用量。具体操作步骤：

1）在96 孔板的每个检测孔中加入200 μL ABTS 工作液。

2）空白对照孔中加入10 μL 蒸馏水或PBS 等适当溶液，标准曲线检测孔内加入10 μL 各种浓度的Trolox 标准溶液，样品检测孔内加入10 μL样品，轻轻混匀。

3）室温孵育2～6 min，于波长734 nm 处测定吸光度。

4）根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力，用Trolox 等效抗氧化能力（Trolox Equivalent Antioxidan Capacily，TEAC）来表示。

1.2.2 羟自由基清除能力测定 通过3.0 mg/mL柚皮苷、1.0 mg/mL Naringin DC、0.50 mg/mL NHDC、0.15 mg/mL 槲皮素与羟自由基反应，测定其吸光值，绘制Trolox（0.01，0.025，0.05，0.10，0.15 mg/L）标准曲线，计算其与Trolox 的当量，进而比较抗氧化能力强、弱。

按照表1 所列顺序向酶标板中加入对应试剂，按表1 规定的条件操作，以Trolox 为标准品绘制标准曲线。

表1 样品及Trolox 的抗氧化能力测定方法Table 1 Determination method of antioxidant capacity for sample and trolox

样品的抗氧化能力根据式（1）进行计算。抗氧化能力值以Trolox 相同抗氧化能力时的用量（μmol Trolox 物质的量/g）表示，即1 g 样品相当于Trolox 的μmol 数。

式中，A样品——样品吸光度；A空白——样品空白吸光度；ATrolox——Trolox 溶液吸光度；mTrolox——Trolox 溶液的物质的量（μmol）；m样品——样品的质量（mg）。

1.2.3 FRAP 法测定样品的铁离子还原能力 通过3.0 g/L 柚皮苷、1.0 g/L Naringin DC、0.30 g/L NHDC、0.025 mg/mL 槲皮素与ferric-TPTZ 自由基反应，测定其吸光值，绘制维生素C（25，50，100，200，400，800 μmol/L）标准曲线，计算其与维生素C 的物质的量，比较抗氧化能力强、弱。

在酶标板的每孔中，依次加入10 μL 不同浓度的维生素标准品溶液或样品和300 μL 的ferric-TPTZ 工作液【300 mmol/L 醋酸盐缓冲液（0.31 g 三水合醋酸钠+1.6 mL 冰醋酸+超纯水至100 mL，pH 3.6】、10 mmol/L TPTZ 的40 mmol/盐酸溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，以体积比10∶1∶1 混合），室温反应30 min 后，于波长593 nm处用酶标仪测定其吸光度。吸光值的大小与样品的抗氧化能力成正比。维生素C 的标准曲线配制浓度为：25，50，100，200，400，800 μmol/L，测定结果以维生素C 为参考标准，结果表示为μmol AAE/g 干重。平行测定3 次，结果取平均值计算。

1.2.4 ORAC 法测定样品的氧自由基清除能力通过3.00 g/L 柚皮苷、1.00 g/L Naringin DC、3.00 g/L NHDC、0.0125 mg/mL 槲皮素与过氧自由基反应，测定其吸光值，绘制Trolox（62.5，125，250，500，500，1000 mol/L）标准曲线，计算其与Trolox的物质的量，比较抗氧化能力强、弱。

该方法以偶氮类化合物AAPH 作为过氧自由基来源，荧光素钠盐为荧光指示剂。将荧光素钠盐、AAPH 和水溶性维生素C 类似物Trolox 分别用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）溶解，在96 孔板中依次加入25 μL 各浓度的Trolox 标准品溶液和样品以及200 μL 荧光光素钠盐溶液（8.68 nmol/L），然后，将孔板放入荧光酶标仪中，用Gene5 软件编程操作，37 ℃预热30 min，迅速加入AAPH 溶液25 μL（153 mmol/L），自动振荡摇匀，在激发波长485 nm，发射波长528 nm 处用荧光酶标仪测定。初始吸光强度值记为f0，以后每隔1 min 测定一个点，共测定120 min，荧光强度分别记为f0，f1，f2…f120，根据公式（2）统计各浓度的曲线下面积AUC 值。ORAC 的含量越高，抗氧化能力越强。

Trolox 标准曲线配制浓度分别为62.5，125，250，500，1000 μmol/L，测定结果以Trolox 为参考标准，结果表示为μmol Trolox（TE）/g 干重。平行测定3 次，结果取平均值计算。

1.2.5 Naringin DC 与人铜锌超氧化物歧化酶SOD 的分子对接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0画出化合物槲皮素和Naringin DC 的结构，然后用ChemBio3D Ultra 14.0 转化为三维结构，并用Sybyl 软件的MMFF94 力场进行优化。人铜锌超氧化物歧化酶SOD 的三维结构（PDB ID：3RE0）从RCSB 蛋白数据库下载。铜锌超氧化物歧化酶和化合物均使用AutodockTools 1.5.6 转化为PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2 进行分子对接。铜锌超氧化物歧化酶活性位点的坐标设置为：size_x=15，size_y=15，size_z=15；center_x=1.346，center_y=-3.077，center_z=30.419。为了增加计算的准确度，将参数exhaustiveness 设置为20。除了特别说明，其它参数均采用默认值。最后，选取打分值最高的构象用PyMoL1.7.6 进行结果分析[10-12]。

1.2.6 酪氨酸酶活性抑制试验 通过熊果苷（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、柚皮苷（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、Naringin DC（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、NHDC（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）与酪氨酸酶反应测定其吸光值并绘制曲线，求出IC50值，进而比较抗氧化能力强、弱。

以多巴（L-DOPA）为底物，测定酪氨酸酶的活性。先将待测样品用无水乙醇溶解，配制成质量浓度为1 mg/mL 的贮备液，再依次稀释成不同浓度的样品溶液。按表2所示，依次准确吸取不同浓度的样品溶液，pH 6.8 的0.5 mol/L 磷酸盐缓冲溶液，0.5 mmol/L L-DOPA 溶液和0.15 mg/mL 酪氨酸酶溶液，充分混匀，在37 ℃水浴锅中孵育反应30 min，然后立即测定各试管中反应溶液在475 nm 处的吸光值。上述试验均重复3 次。

根据酶反应活性的定义，在一定的抑制剂浓度下，酶反应活性表示为ACTi，在没有抑制剂时酶反应活性表示为ACT0，则受试样品对酶的相对抑制率（I）可以定义为：

图1 槲皮素（a）和Naringin DC（b）的结构Fig.1 Structure of quercetin（a）and naringin dihydroderone（b）

表2 酶活力测定中反应液的组成（μL）Table 1 The composition of the reaction fluid in the determination of enzyme activity（μL）

式中，ACTi——有抑制剂时的酶反应活性；ACT0——没有抑制剂时的酶反应活性；A1，A2，A3，A4——1，2，3，4 号反应液的吸光值。

1.2.7 B16 黑色素瘤细胞细胞MTT 试验 称取50 g 重铬酸钾固体，以100 mL 蒸馏水100 ℃溶解（电炉加热），快速加入900 mL 浓H2SO4，混匀，冷却即可使用。MTT 用PBS 配制成质量浓度5 mg/mL，过0.22 μm 水相滤膜后存于10 mL 无菌离心管中，于-20 ℃冷冻保存。具体步骤：

1）取柚皮苷、Naringin DC 和熊果苷的标准品20 mg，加入DMSO 溶解配成500 mmol/L 的母液，过0.22 μm 有机滤膜后以每管20 μL 分装于无菌的200 μL 离心管中，于-20 ℃冷冻保藏。

2）不同浓度样品的配制 分别取柚皮苷、Naringin DC 和熊果苷3 种物质500 mmol/L 的母液各4 μL，加入4 mL 1640 基础培养基中，配成500 μmol/L 的溶液，然后分别稀释到250，125，62.5 μmol/L 3 个浓度。

3）96 孔细胞培养板培养细胞 在超净工作台中移取5 mL 75T 细胞培养瓶终止消化后的细胞与培养液的混合液于离心管中，800 r/min 离心4 min，弃上清液，移取3 mL 完全培养基于离心管并混匀细胞液，取上述1 mL 细胞液，加1 mL 完全培养基，取80 μL 于平板计数器计数，用完全培养基稀释调整细胞浓度为8 000 个细胞/100 μL，用12 通道移液枪将细胞液混匀，加入96 孔细胞培养板，每孔加入100 μL，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24 h。

4）96 孔细胞培养板中加入样品 将上述96孔细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24 h，用废液真空泵吸弃细胞培养液，每孔加入不同浓度的样品150 μL，并且每块96 孔板都要留1 到2列只加基础培养基做空白对照，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24 h。

5）B16 黑色素瘤细胞的MTT 试验 在超净工作台中，取PBS 配成质量浓度5 mg/mL 的MTT溶液，与基础培养基以体积比1∶9 的比例配成MTT 细胞培养液。将步骤4）中加样品培养24 h后的细胞培养液用废液真空泵吸弃，每孔加入150 μL MTT 细胞培养液，做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养4 h，吸弃MTT 细胞培养液，每孔加入150 μL DMSO，于酶标仪中振动10 min 后测定波长490 nm 处的吸光度值。

细胞存活率=（A0-Ax）/A0×100%

式中，A0——不加样品的空白吸光度值；Ax——加不同浓度样品作用后的吸光度值。

1.2.8 B16 黑色素瘤细胞Hoechst 荧光染色试验具体操作步骤：

1）于超净工作台上，打开六孔板，置灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片上，置CO2体积分数为5 %的培养箱中，37 ℃培养至细胞固着（约2 h），加入2 mL 细胞培养液继续培养约6 h。弃培养基，用PBS 洗3 次，每次5 min。

2）用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min。

3）切片稍甩干后在圈内滴加适量Hoechst染液到爬片上，室温避光孵育15 min。

4）PBS 漂洗爬片3 次，每次5 min，从六孔板内取出爬片，将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.9 Naringin DC 与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0 画出化合物熊果苷和Naringin DC 的结构，然后用Chem-Bio3D Ultra 14.0 转化为三维结构，用MMFF94 力场进行优化。双孢蘑菇酪氨酸酶的三维结构（PDB ID：2Y9X）从RCSB 蛋白数据库下载。酪氨酸酶和化合物均使用AutodockTools 1.5.6 转化为PDBQT 格式。采用Autodock vina 1.1.2 进行分子对接。酪氨酸酶活性位点的坐标设置为：center_x=-10.044，center_y=-28.706，center_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。为了增加计算的准确度，将参数exhaustiveness 设置为20。其它参数均用默认值。最后，选取打分值最高的构象用PyMoL 1.7.6 进行结果分析。

图2 熊果苷（a）和柚皮苷二氢査尔酮（b）的结构Fig.2 Structure of arbutin（a）and naringin dihydroderone（b）

2 结果与讨论

2.1 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素对ABTS 自由基的清除效果

以Trolox 作为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y= 0.3627x + 0.0661（R2= 0.9943），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 种样品对ABTS 自由基清除效果，结果见图3。4 种样品对ABTS 自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物质的量表示，结果见表3。

由表3 可知，4 种样品对ABTS 自由基均有清除作用。以Trolox 作为对照，4 种样品的总抗氧化能力结果中，柚皮苷的Trolox 抗氧化物质的量为0.1748 mmoL/g，NHDC 为2.9109 mmoL/g，Naringin DC 为0.6986 mmoL/g，槲皮素为39.6103 mmoL/g。4 种样品对ABTS 自由基清除能力依次为槲皮素＞NHDC＞Naringin DC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素对羟自由基的清除效果

以Trolox 为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y = 4.0588x + 0.079（R2= 0.9998），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 种样品对羟自由基清除效果，结果见图4。4 种样品对羟自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物质的量表示，结果见表4。

由表4 可看出，4 种样品对羟自由基均有清除作用，试验中以Trolox 作为对照，得到柚皮苷清除能力的Trolox 物质的量为19.8 μmoL/g，Naringin DC 为31.9 μmoL/g，NHDC 为44.4 μmoL/g，槲皮素为365.5 μmoL/g。4 种样品清除羟自由基能力依次为槲皮素＞NHDC＞Naringin DC＞柚皮苷。

图3 Trolox 清除ABTS 自由基标准曲线Fig.3 Standard curve of scavenging ABTS Trolox

图4 Trolox 清除羟自由基标准曲线Fig.4 Standard curve of hydroxyl radical scavenging activity of Trolox

表3 4 种样品对ABTS 自由基的清除作用Table 3 Scavenging effect of 4 samples on ABTS

表4 羟自由基清除作用Table 4 Scavenging effect of hydroxyl radicals

2.3 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素对铁离子的还原作用

研究了柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 种样品对铁离子的还原作用，以VC 为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y = 0.0006x +0.0943（R2=0.9998），4 种样品对铁离子的还原作用以VC 的相等还原能力时的用量表示，结果如表5所示。

由表5 可看出，4 种样品对三价铁离子均有还原作用。以维生素C 为对照，柚皮苷的VC 抗氧化物质的量为66.48 μmoL/g，Naringin DC 为72.67 μmoL/g，NHDC 为339.63 μmoL/g，槲皮素为32 751.11 μmoL/g。4 种样品对铁离子还原能力依次为槲皮素＞NHDC ＞Naringin DC ＞柚皮苷。

2.4 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素对氧自由基的清除效果

以Trolox 为对照，以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.0398x+92.858（R2=0.99），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 种样品对氧自由基的清除效果，结果见图6。按照1.2.4 节方法统计样品各浓度的AUC 值，4 种样品对氧自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物质的量表示，结果见表6。

由表6 可知，4 种样品清除氧自由基作用排序为槲皮素＞Naringin DC ＞NHDC ＞柚皮苷，柚皮苷的抗氧化性远小于2 种二氢查尔酮，说明在柚皮苷加氢过程中结构发生改变，加氢产物的抗氧化性提高。

图5 VC 标准曲线Fig.5 Standard curve of vitamin C

图6 Trolox 清除氧自由基标准曲线Fig.6 Standard curve of scavenging oxygen free radical of Trolox

表5 4 种样品对铁离子的还原作用Table 5 Reduction of iron ions of four samples

表6 样品对氧自由基清除作用Table 6 The scavenging effect of samples on the oxygen free radical

2.5 Naringin DC 与人铜锌超氧化物歧化酶SOD 对接结果

为了从分子水平阐明槲皮素与人铜锌超氧化物歧化酶的作用模式，将槲皮素对接至铜锌超氧化物歧化酶的活性口袋。槲皮素与铜锌超氧化物歧化酶的结合模式如图7a所示，由图7 可以看出，槲皮素分子位于一个由氨基酸残基A/Leu-106、A/Cys-111、A/Ile-113、A/Ile-151、B/Cys-111和B/Ile-113 组成的疏水性腔袋，形成稳定的疏水性相互作用。详细分析可得出：槲皮素的苯环可与氨基酸残基B/Arg-115 形成阳离子-π 相互作用。重要的是，槲皮素的羟基可与氨基酸残基A/Gly-108 形成长为2.7 Å 的氢键作用。所有这些相互作用使得槲皮素与铜锌超氧化物歧化酶形成稳定的复合物。

为进一步阐明Naringin DC 与铜锌超氧化物歧化酶的结合模式，将Naringin DC 对接至铜锌超氧化物歧化酶的活性口袋，结果如图7b所示。Naringin DC 位于一个由氨基酸残基A/Leu-106、A/Cys -111、A/Ile -113、A/Ile -151、A/Ile -112、B/Leu-106、B/Ala-1、B/Ile-113、B/Cys-111 和B/Ile-151 所组成的疏水性腔袋，并形成强烈的疏水性相互作用。分析可知，Naringin DC 的末端苯环可与氨基酸残基B/Arg-115 形成阳离子-π 相互作用。重要的是，Naringin DC 可分别与氨基酸残基A/Leu-106、A/Gly-108、A/Cys-111 形成长为2.3，2.1 Å 和2.6 Å 的三重氢键作用。所有这些相互作用使得Naringin DC 与铜锌超氧化物歧化酶形成稳定的复合物。

此外，槲皮素和Naringin DC 与人铜锌超氧化物歧化酶的结合能分别为-28.4512 kJ/mol和-29.288 kJ/mol。此结果表明槲皮素和Naringin DC 可能为铜锌超氧化物歧化酶的抑制剂，且Naringin DC 的活性优于槲皮素。

总之，上述分子对接研究对化合物槲皮素和Naringin DC 与人铜锌超氧化物歧化酶的相互作用给予合理的解释，为从分子水平解释其相互作用提供了新思路。

图7 对接结果Fig.7 Docking results

2.6 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及熊果苷4 种样品对酪氨酸酶的抑制作用如图8所示。根据不同质量浓度的各样品对酪氨酸酶的抑制率，采用对数方程拟合，得到拟合曲线如表7所示。根据拟合方程计算得到IC50值。

根据表7 可看出，4 种样品对酪氨酸酶均有抑制作用。由柚皮苷对酪氨酸酶抑制作用的拟合曲线计算得到IC50=33.58 mg/mL；由Naringin DC拟合曲线计算得到IC50=13.22 mg/mL；由NHDC 拟合曲线计算得到IC50=13.79 mg/mL；由熊果苷拟合曲线计算得到IC50=13.09 mg/mL。比较它们的IC50可以看出：4 者对酪氨酸酶抑制能力排序为NHDC ＞熊果苷≥Naringin DC ＞柚皮苷。

2.7 Naringin DC 与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接结果

为从分子水平阐明熊果苷与双孢蘑菇酪氨酸酶的作用模式，将熊果苷对接至酪氨酸酶的活性口袋。熊果苷与酪氨酸酶的结合模式如图9a所示。

图8 4 种样品对酪氨酸酶的抑制效果Fig.8 Inhibitory effect of 4 kinds of samples on tyrosinase

表7 酪氨酸酶抑制作用的IC50 值Table 7 IC50 values of the inhibitory effect on tyrosinase

由图9 可看出，熊果苷分子位于一个由氨基酸残基Val-248、Phe-264、Met-280、Val-283 和Ala-286 所组成的疏水性腔袋，形成稳定的疏水性作用。分析可知，熊果苷苯环上的4 位羟基可与氨基酸残基His-263 形成长为2.6 Å 的氢键作用。所有这些相互作用使熊果苷与酪氨酸酶形成稳定的复合物。为进一步阐明Naringin DC 与酪氨酸酶的结合模式，将Naringin DC 对接至酪氨酸酶的活性口袋，结果如图9b所示。Naringin DC 分子位于一个由氨基酸残基Phe-264、Pro-277、Met-280、Val-283、Pro-284 和Ala-286 所组成的疏水性腔袋，并形成强烈的疏水性作用。分析可知，Naringin DC 的末端苯环可分别与氨基酸残基Phe-264 和His-263 形成π-π 堆积作用以及CH-π 相互作用。重要的是，Naringin DC 可分别与氨基酸残基His-244 和Met-280 形成长为2.6 Å 和2.0Å 的双重氢键作用。所有这些相互作用使Naringin DC 与酪氨酸酶形成稳定的复合物。

此外，熊果苷和Naringin DC 与双孢蘑菇酪氨酸酶的结合能分别为-25.104 kJ/mol 和-27.6144 kJ/mol，推测熊果苷和Naringin DC 均可能为酪氨酸酶的抑制剂，且Naringin DC 的活性优于熊果苷。

图9 对接结果Fig.9 Docking results

图10 MTT 试验结果Fig.10 MTT experimental results

总之，上述分子对接研究对化合物熊果苷和Naringin DC 与双孢蘑菇酪氨酸酶的相互作用给予合理的解释，为从分子水平解释其相互作用提供新思路。

2.8 小鼠黑色素瘤B16 细胞MTT 试验结果

由图10 可看出，Naringin DC、柚皮苷和熊果苷在500 μmol/L 及以下浓度，由B16 细胞MTT 试验测得的细胞存活率均大于90%，说明Naringin DC、柚皮苷和熊果苷在500 μmol/L 及以下浓度是B16 细胞的安全浓度。

2.9 B16 黑色素瘤细胞Hoechst 荧光染色试验结果

由图11 可看出，在浓度500 μmol/L 条件，柚皮苷组、Naringin DC 组和熊果苷组与空白组对比，细胞密度与数量相近，表明细胞没有凋亡，因此500 μmol/L 是药物组的安全浓度。

图11 荧光染色试验结果Fig.11 Experimental results of fluorescence staining

3 结论

利用4 种常见的抗氧化和分子对接方法研究了柚皮苷二氢查尔酮的抗氧化活性，通过测定酪氨酸酶活性研究了其美白活性，通过MTT 试验测定了其细胞毒性，所得结论：柚皮苷二氢查尔酮具有较好的抗氧化性和美白活性，对小鼠黑色素瘤B16 细胞的安全浓度为≤500 μmol/L。