VC脂质体水凝胶的制备及其消化特性研究

张晨曦，董 露，卢雨洁，宣时钊，刘玮琳，韩剑众

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

脂质体（liposome）是由两亲分子在水中自组装形成的微球体，它通常由天然磷脂和胆固醇组成。20世纪60年代，英国学者Bangham 等[1]将磷脂分散在水中后发现，磷脂可自发形成多层的封闭式囊泡结构，将其命名为脂质体。鉴于其具有较高的生物相容性和生物降解性，尺寸可调控性和表面可修饰等优点，在过去的几十年里，脂质体的研究已从靶向药物的包埋和提高基因治疗效率，扩展到食品工业对亲水、亲油性营养素的运载，如功能性脂质、抗氧化剂、酶与蛋白质以及维生素和矿物质[2-4]等，从而提高被包埋物的稳定性和生物利用率，同时达到定时、定位释放的目的[5]。然而，由于传统脂质体一般由卵磷脂和胆固醇等组成，属于热力学不稳定体系[6]，容易受到外界光照、pH值、温度等条件影响，产生聚集、药物泄露、磷脂氧化等现象[7-8]。人体摄入后在消化系统中脂质体易被低酸、酶等降解，被包埋物提前释放而失活，生物利用性降低，这些缺点在很大程度上限制了脂质体在食品中的广泛应用[9]。

水凝胶是高分子材料形成的亲水性三维空间网状结构，其亲水基团与水分子结合，将水分子连接在网状内部，性质柔软、吸水量大，可维持一定的形状。水凝胶按其原料来源可分为天然与合成两大类，其中，天然的亲水性高分子包括多糖类（淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖等）和多肽类（胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸等）。水凝胶形成方式可分为化学交联和物理交联。化学交联是指高分子链通过共价键互相连接，形成具有更高机械强度的凝胶，然而多数化学交联剂（如戊二醛、碳化二亚胺和二苯基磷酰基叠氮化物）具有细胞毒性，使细胞存在接触残留有毒化学品的风险[10-11]。物理交联则使用盐离子与酶，使高分子链之间通过氢键、离子键、疏水性相互作用等方式连接形成网状凝胶结构[12-13]。水凝胶可以吸收大量水分，使得水凝胶能够包封药物并降低其降解速度；此外，水凝胶可在一定程度控制被包封药物的释放速率，具有广阔的应用价值[14]。

近来，研究人员将脂质体与水凝胶结合，制备成新型水凝胶药物载体，成功突破了脂质体应用的限制，并在运输上表现出更优越的性能。在医药学领域，Cheng 等[15]将脂质体与明胶甲基丙烯酰分子通过UV 光交联制备脂质体水凝胶，除了具有优异的药物释放特性，在压缩、拉伸和周期性循环上还表现出优异的机械性能；李伟泽等[16]将黄藤素柔性纳米脂质体制备成治疗奶牛乳房炎的一种新型高效透皮水凝胶贴剂，相比传统贴剂，具有药物透皮吸收效率更高、黏附性更好、使用更方便的优势；另外，El Kechai 等[17]研究发现，可通过向中耳施用透明质酸脂质体凝胶以持续将肾上腺皮质激素递送至内耳。在食品领域，Tan 等[18]通过薄膜蒸发法制备类胡萝卜素脂质体，再用壳聚糖静电吸附生物聚合物包覆脂质体，进而提高了类胡萝卜素对环境胁迫的稳定性。然而，目前大部分脂质体水凝胶的研究聚焦于医药和护肤行业，鲜有在食品领域应用的报道，也缺乏对这种胶状体系在体内消化行为的探究。脂质体水凝胶在食品领域的研究和应用具有广阔的探索空间。

作为人体必需的营养素之一，维生素C（vitamin C，VC）易在外界环境的影响下发生氧化变性。本研究以VC 为模型营养素，通过脂质体技术将其包埋，采用卡拉胶和乳清分离蛋白通过谷氨酰胺转氨酶和钠离子进行物理交联形成凝胶，再将脂质体和水凝胶结合制备脂质体水凝胶，达到脂质体包埋、水凝胶运载双重控释营养物的目的。另外，通过研究脂质体水凝胶的磷（Pi）释放率、脂质体氧化程度、VC 释放率、平均粒径及粒度分布、脂质体水凝胶降解速率等，评价VC 脂质体水凝胶的储存和体外消化稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无机磷（Pi）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、抗坏血酸（VC）测试盒，南京建成生物工程研究所；磷脂、胆固醇、VC，美国Sigma 公司；N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸钠盐（HEPES）、κ-卡拉胶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷氨酰胺转氨酶TG-H，泰兴市一鸣生物制品有限公司；猪胃黏膜胃蛋白酶、猪胰脏中胰酶、胆盐，美国Sigma 公司；NBD-PE，美国Molecular ProbesR公司；Fast Green，英国Sterilin 公司；其它无机试剂均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

组织分析仪（TA.XT Plus 型），德国IKA 公司；全波长酶标仪（Multiskan Spectrum），美国Thermo Scientific 公司；激光粒度分析仪（MS3000型），英国Malvern 公司；高内涵成像系统（Image Xpress Micro XLS System），美国Molecular Devices 公司；旋转蒸发仪（RV 10 D S96 型），德国IKA 公司；振荡水浴槽（SW22 型），德国Julabo 公司；高速冷冻离心机（SORVALL BiofugeRPrimo R型），美国Kendro 公司；台式冷冻离心机（Prism R型），美国Labnet 公司；高速剪切机（T18 digital型），德国IKA 公司。

1.3 方法

1.3.1 脂质体水凝胶的制备

1.3.1.1 脂质体的制备 采用薄膜分散法制备脂质体[19]。以质量比6∶1 的比例称取磷脂和胆固醇，溶解于一定量的无水乙醇中，用磁力搅拌器搅拌至固体物质完全溶解。采用旋转蒸发仪抽真空除去无水乙醇，待形成脂质薄膜，沿圆底烧瓶壁缓缓加入含VC 的10 mmol/L HEPES 缓冲溶液（pH 7.4），在53 ℃、80 r/min 条件下充分洗膜约1 h，获得VC 质量浓度约5 mg/mL（研究脂质体水凝胶储存稳定性时不加VC）、磷脂及胆固醇质量浓度为8 mg/mL 的脂质体。

为防止磷脂和VC 氧化分解，制备过程需全程避光。HEPES 缓冲液的配制方法是：称取1.1915 g N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸，溶解在480 mL 0.8%氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH 值至7.4，定容500 mL。

1.3.1.2 脂质体水凝胶的制备 将上述脂质体按照6 mg/mL κ-卡拉胶、0.8%乳清分离蛋白（WPI）、0.1 mol/L 氯化钠、10 U/mL 谷氨酰胺转氨酶的配比，制备脂质体水凝胶。

分别将WPI 和κ-卡拉胶用超纯水溶解，于50 ℃水浴加热30 min，各取2 mL 溶液混合并搅拌。陆续将0.5 mL 谷氨酰胺转氨酶溶液、0.5 mL氯化钠溶液加入上述混合物中，继续搅拌。随后，加入1 mL 脂质体，将混合物搅拌均匀。将混合物继续置于50 ℃振荡水浴槽加热，30 min 后即可制得脂质体含量为16.7%（质量分数）的脂质体水凝胶。将成品于4 ℃保存，24 h 后再进行后续检验。

1.3.2 脂质体水凝胶储存稳定性研究

1.3.2.1 外观拍照 将脂质体水凝胶置4 ℃冰箱中储存，分别于第1，3，7，14，30 天取出，对其外观拍照，观察样品外观随时间的变化。

1.3.2.2 Pi 释放量 根据无机磷测定试剂盒方法，测定不同储存时间（1，3，7，14，30 d）样品的Pi释放量，间接阐析脂质体释放速率。具体步骤为：分别取不同储存时间点的样品，以3 000 r/min 离心10 min[20]。取0.1 mL 上清液，加入0.4 mL 沉淀剂后充分混匀，再以3 500 r/min 离心10 min。取0.2 mL 待测上清液、0.5 mmol/L 标准品和去离子水，加入2 mL 工作液混匀，分别制备样品管、标准管和空白管，然后37 ℃水浴30 min，再冷却至室温。采用全波长酶标仪测定各组样品的吸光度值，测定条件为：波长660 nm，光径1 cm。根据公式计算各组样品的Pi 含量，研究水凝胶中脂质体的释放程度。公式如下：

1.3.2.3 脂质氧化程度 根据丙二醛（MDA）测定试剂盒方法，测定不同储存时间（1，3，7，14，30 d）脂质体水凝胶的脂质氧化程度。具体步骤为：分别取不同储存时间点的样品，以3 000 r/min 离心10 min[20]。取0.1 mL 上清液、10 nmol/mL 标准品和无水乙醇，加入0.1 mL 试剂一，分别制备样品管、标准管和空白管，混匀后依次加入3.0 mL 试剂二应用液、1.0 mL 试剂二应用液。用旋涡混匀器混匀后，置于95 ℃水浴锅加热40 min 后取出，用流水冷却，再以4 000 r/min 离心10 min。取上清液，采用全波长酶标仪测定各组样品的吸光度值，测定条件为：波长532 nm，光径1 cm。根据公式计算出各组样品的MDA 含量，研究水凝胶的脂质氧化程度。其计算公式：

1.3.3 脂质体水凝胶消化性研究 参照Minekus等[21]的方法，经改良配制模拟口腔液、模拟胃液和模拟小肠液，配方如表1所示。

1.3.3.1 脂质体水凝胶模拟体外消化

1）消化前处理：将样品用高速剪切机以6 Hz 频率，先剪切6 s，搅拌均匀后再剪切5 s。

2）模拟口腔消化：消化前处理完成后，称取4 g 样品，依次向其中加入3.2 mL 口腔模拟消化液（simulated saliva fluid，SSF）、20.0 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.78 mL 超纯水，调节pH 值为7，然后置于37 ℃恒温水浴摇床反应2 min，做3 组平行试验。

表1 体外模拟消化液成分Table 1 In vitro digestive fluids composition

3）模拟胃消化：向经过口腔模拟消化2 min后的消化样品中依次加入4.8 mL 胃模拟消化液（simulated gastric fluid，SGF）、30.0 μL 0.03 mol/L CaCl2溶液、1.00 mL 超纯水，调节pH 值为3，再加入0.15 mL 2 000 U/mL 胃蛋白酶溶液，然后置于37 ℃恒温水浴摇床反应。分别在消化30，60 min 和120 min 时取样，做3 组平行试验。

4）模拟小肠消化：向经过胃部模拟消化120 min 后的消化样品中依次加入4.3 mL 小肠模拟消化液（simulated intestinal fluid，SIF），0.57 mL 胆汁，12.0 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.57 mL超纯水，调节pH 值为7，再加入0.5 mL 100 U/mL胰酶溶液，然后置于37 ℃恒温水浴摇床反应。分别在消化30，60 min 和120 min 时取样，做3 组平行试验。

1.3.3.2 消化样品的离心 将各消化时间点的消化样品稀释至相同体积，以1 500×g 离心10 min，取部分上清液用于后续检测。

1.3.3.3 消化样品平均粒径及粒径分布 参照Sun 等[22]的测定方法，取1.3.3.2 节的上清液，采用激光粒度分析仪测定消化样品的平均粒径和粒径分布。

1.3.3.4 微观结构 分别取未消化，口腔消化2 min，胃消化30，60，120 min，小肠消化30，60，120 min 的消化样品，用高内涵成像系统观察消化过程中脂质体水凝胶的微观结构变化[23]。脂质体用NBD-PE 染色，激发和发射波长分别为463 nm 和536 nm；WPI 用固绿染色，激发和发射波长分别为633 nm 和760 nm。

1.3.3.5 Pi 及其包埋物VC 的释放量 根据无机磷测定试剂盒的方法测定不同消化时间点消化样品的Pi 释放量。具体步骤如1.3.2.2 节所示。

根据抗坏血酸测定试剂盒方法测定不同消化时间点消化样品的VC 释放量。具体步骤为：分别取不同消化时间点消化样品离心后的上清液0.15 mL，加入0.45 mL 试剂一应用液，旋涡混匀，放置15 min 后以4 000 r/min 离心10 min，上层清亮液体为上清液。取0.4 mL 上清液、6 μg/mL 标准品和去离子水，依次加入0.5 mL 试剂二应用液、1 mL试剂三应用液、0.25 mL 试剂四应用液，制备样品管、标准管和空白管，充分混匀后37 ℃水浴30 min，加入0.1 mL 试剂五应用液。充分混匀后静置10 min，采用全波长酶标仪测定各组测定管吸光度值，测定条件为波长536 nm，光径1 cm。计算各组样品的VC 含量。其计算公式如下：

1.4 数据处理

脂质体水凝胶各指标的测量均为3 次平行试验所得数据，所有图表通过Excel 2016 和Origin 8.5 分析制作得到，所有统计值按平均数±标准差（≤0.05）。

2 结果与分析

2.1 脂质体水凝胶储存稳定性

2.1.1 外观变化 由图1 可知，在储存期内，脂质体水凝胶的外观总体上没有发生很大变化。第7天观察到脂质体水凝胶有少许水分析出，第14 天和第30 天均可观察到脂质体水凝胶有轻微失水现象。整体外观上，脂质体水凝胶的颜色、均匀程度等均无明显差异。由此可知，储存期间脂质体水凝胶的表观稳定性较好。

图1 不同储存时间脂质体水凝胶的外观变化Fig.1 Changes in appearance of liposomal hydrogels during storage

2.1.2 脂质体释放量及氧化程度 脂质体的主要成分为磷脂，而水凝胶中其它物质几乎不含Pi 元素，可采用测定Pi 含量代表脂质体的释放量。由图2a 可知，储存期前14 d，脂质体水凝胶的Pi 释放量约为0.124 mmol/L；从第14 天至第30 天，释放量增约为0.20 mmol/L。其原因可能是脂质体水凝胶在储存过程中逐渐失水，水凝胶的结构变得松散，脂质体从水凝胶中不断游离。随着储存时间的延长，水凝胶的结构变化越大，游离出的脂质体越多。总体而言，在一定的贮藏时间内（30 d），脂质体水凝胶可维持较低脂质体释放量，表明其包裹脂质体能力较强，该结果与外观结论相吻合。

脂质体中的磷脂的大多含有不饱和脂肪酸，这使脂质体在制备和放置过程中极易发生氧化形成过氧化脂质[24]，而过氧化脂质的降解产物中含有丙二醛（MDA），可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合形成红色产物。基于此原理，可采用MDA 试剂盒测定样品中的MDA 含量，研究脂质体的氧化程度。由图2b 可知，在储藏期内，脂质体水凝胶的氧化程度呈缓慢上升趋势。第1 天至第3 天，脂质体水凝胶氧化程度上升较快，MDA 含量增幅约0.47 nmol/mL；从第3 天开始，MDA 含量增长速率明显减小，4 d 内仅增长约0.35 nmol/mL；从第7 天至第30 天，MDA 含量缓慢增加约0.45 nmol/mL。本试验制备的脂质体中含有胆固醇成分。根据王宁等[25]的研究，胆固醇对脂质体的过氧化损伤有很好的保护作用。同时水凝胶起到将脂质体与外界阻隔的作用，有效降低了氧化水平。丁宝淼[26]在考察壁材组成、芯壁比、芯材类型对脂质体氧化的影响时发现，在蛋黄卵磷脂：胆固醇为8∶1（质量比）时脂质氧化程度最低，然而，该脂质体在1 个月储存期内的MDA 释放量高达5.55 nmol/mL，远高于本研究中脂质体的氧化速率。这进一步说明水凝胶对脂质体有较好的保护性，使脂质体在较长时间内保持较低的氧化程度。

图2 储存期内脂质体释放量（a）及氧化程度（b）的变化趋势Fig.2 Trend of liposomal release（a）and oxidation（b）during storage

2.2 脂质体水凝胶的体外模拟消化特性

图3 脂质体水凝胶消化过程中微观结构变化Fig.3 Microstructural changes during liposomal hydrogel digestion

2.2.1 微观结构变化 本研究分别用NBD-PE和固绿标记脂质体和WPI，采用高内涵成像系统观察脂质体水凝胶在消化过程中的微观结构变化。由图3 可知，在未消化的脂质体水凝胶中，脂质体和WPI 紧密结合，脂质体较为均匀地分布在水凝胶中。模拟口腔消化2 min 后，脂质体和WPI开始分散，而脂质体仍均匀分散于凝胶四周。在模拟胃消化阶段，消化至30 min 时，脂质体和WPI呈小面积聚集状态；60 min 时，脂质体和WPI 逐渐分散，而WPI 仍有部分呈大块状聚集，这与倪莹宙[27]的研究结果一致，即在胃酸条件下，胃蛋白酶无法完全降解WPI；120 min 时，颗粒物的分布更加稀疏，块状的WPI 出现解体现象。在模拟小肠消化阶段，消化至30 min 时，脂质体和WPI 明显分散，且WPI 已分解成小颗粒状，均匀地分布于消化样品中；60 min 时，WPI 颗粒已明显减少，脂质体仍有较多残留；120 min 时，脂质体和WPI几乎分解殆尽。以上现象说明脂质体水凝胶在口腔中较稳定；模拟胃消化后，在胃蛋白酶的作用下WPI 逐渐被分解，但并未完全水解，结合作者前期研究，低酸环境减少脂质体带电量，减小排斥力，促进脂质体聚集[29]，而脂质体结构可基本保持完整[29]。进入模拟小肠环境后，在胰蛋白酶和胰脂肪酶消化下脂质体和WPI 迅速分解。

2.2.2 平均粒径及粒度分布脂质体水凝胶在模拟口腔、胃、小肠消化过后的平均粒径变化如图4 和图5所示。未消化和模拟口腔消化后的样品平均粒径接近。在模拟胃部消化的前期，平均粒径先大幅度地增加，后期又开始逐渐减小；而在模拟小肠消化阶段，平均粒径缓慢减小并逐渐趋于平稳。从图5 可以看出，未消化原样的D[4，3]主要分布在1～2 μm，少有10 μm 以上的颗粒；口腔消化2 min 后的消化样品中开始出现一些的粒径大于10 μm 的颗粒。进入胃消化后，粒径超过100 μm的颗粒逐渐增多，尤其是在胃消化60 min 时，粒径100～1 000 μm 之间出现了一个明显的波峰，之后，波峰逐渐减小。进入小肠消化后，消化样品的粒径逐渐变小（＜10 μm），至120 min 时达到最小状态。此结果与图5 中表格呈现的D[3，2]、Dx（90）等相符。

图4 体外消化过程中脂质体水凝胶平均粒径变化Fig.4 Changes in the average particle size of liposomal hydrogel during in vitro digestion

图5 体外消化过程中脂质体水凝胶粒度分布变化Fig.5 Changes in the particle size distribution of liposomal hydrogel during in vitro digestion

表2 体外消化过程中脂质体水凝胶粒度分布Table 2 The particle size distribution of liposomal hydrogel during in vitro digestion

在模拟胃部消化过程中消化样品中的微粒物质出现聚集现象，这一现象可能与消化环境的pH值有关。模拟胃消化环境呈酸性，由Ringgenberg等[30]的研究可知，在pH 值较低的情况下，蛋白质、多肽等容易发生聚集，使WPI 形成较大的颗粒聚集体；另一个原因可能是由于模拟胃环境中，脂质体间的排斥力减小，微粒间相互靠近聚集，从而形成较大的微粒聚集体。根据刘宇等[31]的研究，胃蛋白酶在50 ℃以下较为稳定，在pH 1.0～5.0 具有较高活性，专一性较强，可水解球蛋白。本研究模拟胃消化环境的温度为37 ℃，pH 3.0，消化样品中的WPI 富含β-乳球蛋白及免疫球蛋白。在此条件下，胃蛋白酶具有较高活性，可对WPI 起显著的水解作用。在模拟胃消化后期，消化样品中的蛋白质逐渐被分解成小的肽片段，粒径呈逐渐减小趋势。进入模拟小肠消化阶段后，消化环境pH 值为7.0，胃蛋白酶失活，然而加入的胰酶中含有胰蛋白酶和胰脂肪酶[32]，分别促进了蛋白质和脂类的水解反应，使WPI 和脂质体被逐渐分解成小分子物质，消化样品中的微粒粒径呈现下降趋势。粒径及其分布结果与微观结构保持一致。

2.2.3 脂质体及其包埋物VC 释放量 脂质体水凝胶经模拟口腔、胃、小肠消化过后Pi 含量变化趋势如图6A所示。脂质体水凝胶经过口腔消化2 min、胃消化120 min，消化样品中Pi 含量缓慢增加，推测在口腔和胃消化过程中，脂质体水凝胶中WPI 逐渐分解，因卡拉胶的存在，水凝胶仍保持一定的结构，从而阻止脂质体的进一步释放。从胃消化至小肠消化，消化样品中Pi 含量明显增大，说明水凝胶进一步分解，更多的脂质体游离出。通过该趋势图可发现，脂质体水凝胶在模拟口腔和胃阶段被破坏的程度较小；而在模拟小肠条件下，脂质体水凝胶开始大量分解，此结果与平均粒径的变化相符。

如图6b所示，随着消化的进行，样品中VC含量的变化与Pi 的释放类似，即在口腔和胃中变化不明显，总体呈缓慢上升趋势。进入小肠消化后，消化样品中的VC 含量开始出现明显增幅，尤其是在消化60 min 时，达到测量的峰值，这可能是由于胰酶对磷脂的水解作用以及胆汁盐与脂质体组分的相互作用[29]。本研究用的猪胰酶中含有脂肪分解酶，包括脂肪酶、磷脂酶A2和胆固醇酯酶。De Haas 等[33]早已发现胰脂肪酶可以催化磷脂中1-脂肪酸的水解，释放出脂肪酸和1-酰基溶血磷脂。胰腺提取物中的磷脂酶A2能够催化磷脂的sn-2 酯键，水解成甘油磷酸和2-酰基溶血磷脂，这使脂质体磷脂双分子层不稳定。Howles 等[34]也证实胆固醇酯酶（胆盐刺激脂肪酶）能够水解磷脂。由于这3 种酶对脂质体磷脂的化学水解作用，脂质组装的有序结构被破坏，VC 从中游离出。在60～120 min，VC 含量又出现明显的下降，可能是由于VC 后期受光照、热或氧气等外界环境的影响，发生氧化变性，使测定结果降低[35]。该结果表明，在模拟口腔和胃阶段，脂质体水凝胶的VC 释放量低，脂质体破坏的程度较小且较为稳定；在模拟小肠中，VC 的释放量明显上升，脂质体开始大量分解。这一趋势与平均粒径的变化趋势相符。Widjaja[36]等也有类似的结论，他们对凝胶、脂质体和脂质体水凝胶的载药性能进行对比，发现普通载药凝胶在12 h 内100%的药物被释放；21 d 后载药脂质体药物释放度为78%；经两种不同化学物修饰的透明质酸脂质体水凝胶，释放度分别降为32%和29%，缓释效果显著优于单一的凝胶或脂质体。综上，脂质体水凝胶对包封物的释放有良好的控制能力。

图6 体外消化过程中Pi 释放量（a）及包埋物VC 释放量（b）Fig.6 Pi release（a）and VC release（b）from liposomal hydrogel during in vitro digestion

3 结论

制备了包埋VC 的脂质体水凝胶，对脂质体水凝胶的储存和体外消化稳定性进行初步研究。结果表明，脂质体水凝胶在1 个月的储存期，外观特征未出现明显差异，脂质体释放量较低，同时脂质氧化程度较低。脂质体水凝胶在模拟口腔和胃环境时，水凝胶物理结构有一定破坏，仅有少量脂质体从凝胶中游离，且脂质体较为稳定；在模拟小肠消化阶段，水凝胶开始大量分解释放出脂质体，以及其中的VC，表现出良好的小肠定点缓释功能。本研究制备的VC 脂质体水凝胶具有较为理想的储存稳定性和消化缓释性，为具有营养物靶向释放需求的食品级运载体系的设计提供了新思路。