石榴皮提取物改善肥胖大鼠糖、脂代谢紊乱的分子机制

张飒乐，魏香兰，李 英，李晓明，方欢乐*

（1 西安培华学院医学院 西安710125 2 西安市胸科医院药剂科 西安710100）

肥胖（obesity）是一种过多脂肪积累并损害人体健康的慢性非传染性疾病，与基因、不良生活习惯、内分泌等多种因素有关[1]。近年来，随着生活方式与饮食结构的改变，肥胖的发生率逐渐升高，目前已成为世界范围内最为流行的营养障碍性疾病。肥胖患者能量摄入大于消耗，主要表现为脂肪过量堆积、脂质代谢紊乱，同时很多肥胖患者多伴有糖尿病、高胰岛素血症等引起胰岛素抵抗，因此肥胖是胰岛素抵抗发生和发展的危险因素[2-3]。脂肪组织病变、代谢过程紊乱固然在胰岛素抵抗中起着重要作用[4]，然而异常的抗氧化防御以及非脂肪组织慢性炎症引起的氧化应激也是胰岛素敏感性的主要调节因素[5-7]。肝脏是维持全身葡萄糖稳态的重要组织器官。在健康条件下，胰岛素能有效抑制肝脏的葡萄糖生成和脂肪分解。当肝脏葡萄糖生成和脂肪细胞脂肪分解受损时，血糖和游离脂肪酸水平升高，后者可促进甘油三酯（triglycerides，TG）的合成和储存，导致肝脂质积累增加和肝损伤[8]。目前肥胖人群在不断扩大，在发达国家30%的成年人和10%的儿童均存在不同程度的非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），而非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗和二型糖尿病又有着千丝万缕的联系。寻找改善肥胖患者肝脏糖、脂代谢紊乱的方法尤为重要。

石榴皮中富含氨基酸、蛋白质、糖及其苷类、酚类和鞣质、有机酸、黄酮类、生物碱、挥发油等化学成分[9]。国内外研究显示石榴皮有抗炎、抗感染、降脂、降糖、抗动脉硬化，防止肝纤维化等多种药理学活性[10-11]。有文献显示石榴提取物可以降低高脂、高糖诱导的大鼠脑抗氧化标志物含量及胆碱酯酶活性，发挥抗氧化能力，起到神经保护作用，防止糖尿病和肥胖的发生[12]。本试验组前期试验发现石榴皮提取物（pomegranatepeels extracts，EPP）通过降低氧化还原反应可有效改善四氯化碳诱发的大鼠肝脏损伤[13]。然而，石榴皮中的有效成分是否可以改善肥胖大鼠肝脏的糖、脂代谢紊乱尚未见报道。本文通过高脂饮食长期诱导建立肥胖大鼠模型，分析石榴皮提取物对肥胖大鼠体重、血脂、血糖以及肝脏糖脂代谢等的影响，为石榴皮提取物防治肥胖、保护肝脏功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

将2 000 g 石榴皮粗粉用10 L 95%乙醇回流提取3 次，每次2 h，过滤，将滤液常压浓缩，回收乙醇至无乙醇，得到棕褐色浸膏730 g（石榴皮醇提物）备用。1 g 醇提物相当于2.8 g 生药量，收膏率为36.50%。提取物原料和提取工艺由西安市胸科医院魏香兰博士提供。

1.2 动物

SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体重180～200 g，由西安交通大学医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（新）003-0001。每6 只大鼠被饲养在一笼，随意饮食觅食；饲养室温度（24±2）℃，湿度50%～60%，12 h 光照/12 黑暗交替。

1.3 试剂

高脂饮食（D12451）和正常脂肪饮食（D12450H）饲料，江苏常州股份有限公司提供。总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBil）和脂肪酸（FFA）试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；大鼠胰岛素（INS）检测ELISA 试剂盒，上海西塘生物科技有限公司；血糖试纸，罗氏诊断产品有限公司；RIPA 裂解液、ECL 化学发光试剂盒，碧云天生物技术研究所；葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）和胰岛素受体底物2（IRS-2），Abcam 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 分组、造模及干预 雄性SD 大鼠180～200 g，正常饲养1 周后被随机分为5 组：空白对照组（sham），大鼠饲养喂对照饲料16 周（D12450H：10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白）；高脂模型（HF）组：大鼠饲喂高脂饮食（D12451：45%脂肪，35%碳水化合物，20%蛋白）16 周；低剂量组【HF+EPP（50）】，大鼠饲喂高脂饲料并每天灌胃给予EPP【50 mg/（kg·d）】；中剂量组【HF+EPP（100）】，大鼠饲养喂高脂饲料并每天灌胃给予EPP（100 mg/（kg·d））；高剂量组【HF+EPP（200）】，大鼠饲喂高脂饲料并每天灌胃给予EPP 【200 mg/（kg·d）】。每周分别测量大鼠体重、体长、食物摄入量，观察大鼠状态。

1.4.2 标本采集及处理 16 周后各组大鼠禁食12 h 后称重，麻醉各组大鼠，腹主动脉取血，离心后血清用于检测血糖和血脂指标水平，取肝脏称质量后计算大鼠肝重比（肝重比=肝脏质量/大鼠体重）。切取肝脏100 mg 置于4%多聚甲醛溶液中固定，以备病理学检测。其余肝脏组织被置于超低温冰箱中以备相关蛋白检测。

1.4.3 血清指标测定 用全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA 的含量，详细流程参见试剂盒说明书（江苏建成生物工程研究所）。用放射免疫分析法测定胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

1.4.4 蛋白印迹法测定肝脏中IRS-2 和GLUT2蛋白表达 取-80 ℃冻存的大鼠肝脏组织50 mg，加入500 μL 含10%PMSF 的增强型RIPA 裂解液提取总蛋白。经30 min 充分裂解，4 ℃高速离心机12 000 r/min 离心10 min，取5 μL 上清液用于蛋白定量，剩余蛋白进行变性处理。蛋白（30 mg/道）上样后，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，电转至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA）上。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后，分别加入特异性一抗IRS-2（1∶1 000）、GLUT2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）孵育，4 ℃过夜。用TBST 摇床清洗PVDF 膜3 次（10 min/次）；用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶7 000）室温下孵育PVDF 膜40 min，再次用TBST 摇床清洗PVDF 膜3 次（10 min/次）。用ECL化学发光试剂对膜进行成像。利用Image J 软件对条带进行统计分析，确定各目的蛋白表达水平的改变。

1.4.5 苏木精-伊红（H&E）染色 4%多聚甲醛固定的肝组织进行石蜡包埋，切片机切至5 μm 厚组织切片。随后进行H&E 染色，显微镜下观察大鼠肝组织细胞形态，镜下观察，染成蓝色的为细胞核，染成红色的为细胞质。（具体方法参见《显微形态学实验》科学出版社）

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计软件，计量结果以均数±标准差误（±s）表示，组间差异应用单因素方差分析（one-way ANOVA），显著性差异应用Tukeys post hoc 检验比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。应用GraphPad Prism 5.0 软件绘制图表。

2 结果

2.1 石榴皮提取物降低肥胖大鼠体重、肥胖指数（Lee’s 指数）、肝重指数

检测各组动物体重、体长和肝质量，结果见表1。与对照组相比，用高脂饲料喂养16 周后大鼠体重明显增加，Lee’s 指数和肝重指数也显著增高（P＜0.05，P＜0.01），说明营养性肥胖大鼠模型建立成功。大鼠被灌胃给予EPP 干预后，与HF 组比较，大剂量EPP 组大鼠体重、Lee’s 指数和肝重指数均明显降低（P＜0.05）；中、小剂量EPP 组大鼠各指标下降不明显，无显著性差异（P＞0.05），表明大剂量石榴皮提取物可抑制高脂饲养诱发的大鼠肥胖和肝脏肥大。

2.2 石榴皮提取物降低肥胖大鼠血脂水平和游离脂肪酸含量

与对照组比较，高脂饮食大鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均显著升高（P＜0.01），HDL-C 水平显著降低（P＜0.01）；与高脂饮食组比较，EPP 不同剂量组均能降低TG、TC 和LDL-C 水平，升高HDLC 血脂水平，其中EPP 大剂量组有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。游离脂肪酸（FFA）是血清中未与胆固醇、甘油等成分酯化的脂肪酸，肥胖人群体内FFA 的含量显著升高。本研究结果显示，高脂饮食组FFA 和空白对照组比较含量明显升高（P＜0.01），不同剂量的EPP 干预高脂饮食大鼠后FFA 均下降，其中大剂量最为显著，有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。

表1 各组大鼠体重、Lee’s 指数及肝重指数比较Table 1 Comparison of body weight，Lee’s index and liver weight index of rats in each group

表2 各组大鼠血清TC，TG，LDL-C，HDL-C 和游离脂肪酸水平Table 2 Serum TC，TG，LDL-C，HDL-C and free fatty acids levels of rats in each group

2.3 石榴皮提取物抑制肥胖大鼠胰岛素抵抗

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是指人体对胰岛素降糖作用的敏感性下降，即胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降。IR 的发生大大增加了心血管、肾、大脑等相关疾病的患病率及死亡率[9]。高脂饲料喂养造模16 周后，取血清进行血糖、胰岛素水平评估。根据公式“HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）×血清胰岛素浓度（mU/L）/22.5”计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。结果显示，高脂饮食组大鼠血糖和胰岛素明显增高，发生胰岛素抵抗（P＜0.01）。不同剂量的EPP 干预高脂饮食大鼠后胰岛素抵抗明显得到改善，尤其大剂量最为显著（P＜0.01），结果见表3。

2.4 EPP 对大鼠肝组织的保护作用

为了明确EPP 对肥胖大鼠肝脏的作用，检测大鼠血清ALT，AST 和T-Bil 水平。结果显示：与空白对照相比，高脂饮食组大鼠血清ALT，AST和T-Bil 显著增加（P＜0.01），EPP 3 个剂量干预后，大、中剂量组ALT，AST 和T-Bil 水平明显低于高脂饮食组（P＜0.01，P＜0.05，图1a～c），小剂量EPP 组ALT，AST 和T-Bil 水平与高脂饮食组比较虽有降低的趋势，但无统计学意义。

表3 各组大鼠血清葡萄糖、胰岛素水平的变化Table 3 Changes of serum glucose and insulin levels of rats in each group

对大鼠肝脏进行HE 染色观察肝脏显微结构，结果显示：空白对照组大鼠肝组织静脉分布均匀，周围肝细胞排列整齐紧密，呈放射状，未见空泡形成。高脂饮食组肝脏细胞明显肿胀，静脉周围细胞排列紊乱，大量空泡形成。与高脂饮食组比较，EPP 组治疗16 周后肝脏显微结构有明显改善，空泡减少（图1d），表明EPP 对高脂饮食大鼠肝脏有明显的保护作用。

图1 EPP 对大鼠肝组织的保护作用Fig.1 Protective effect of EPP on rat liver tissue

2.5 EPP 对肝脏糖代谢的影响

肝脏是机体糖代谢的主要器官，葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）参与胰岛素的合成与分泌。胰岛素受体底物2（IRS-2）是胰岛素信号转导途径的上游分子，两者共同调控血糖的稳定。试验结果显示：与空白组相比，高脂饮食组大鼠肝脏中IRS-2和GLUT2 蛋白表达明显降低，大剂量EPP 可显著改善由肥胖诱发的IRS-2 和GLUT2 表达降低（P＜0.05，P＜0.01，图2），表明EPP 可剂量依赖性地改善肥胖大鼠肝脏糖代谢作用。

图2 EPP 对大鼠肝脏组织糖代谢的影响Fig.2 Effect of EPP on glucose metabolism in rat liver

3 讨论与结论

高脂饲料（45%脂肪）喂养是诱发啮齿动物肥胖的广泛造模方法之一[14]。本试验采用高脂饲料喂养大鼠16 周，模拟能量摄入过度诱发的肥胖模型，试验结束后测定大鼠Lee’s 指数显著性增加。肥胖产生时，机体对脂肪酸的清除和代谢被抑制，进而使血清中FFA 含量升高，过多的游离FFA 以三酰甘油的形式在非脂肪组织——主要在肝脏过度沉积，造成肝脏损伤，即非酒精性脂肪肝。同时，长期处于高浓度FFA 环境中也会损伤β 细胞，导致胰岛素分泌障碍，引起胰岛素抵抗，并有发展为糖尿病的高度风险[15]。本研究结果显示：血脂指标TC、TG、LDL 和FFA 增高，HDL 降低引起脂质代谢紊乱；大鼠肝脏组织功能降低，血清ALT，AST和T-Bil 显著增加，肝脏显微结构受损；模型组大鼠血糖增加，产生胰岛素抵抗。

肝脏脂质沉积是非酒精性脂肪肝的一个潜在特征，高达70%的肥胖个体存在肝脏脂肪化。NAFLD 与其它代谢异常相关，包括高甘油三酯血症和低高密度脂蛋白水平，葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗和2 型糖尿病等[16]。肝脏脂质含量调节转运脂质与肝脏摄取、合成、氧化和分泌脂质之间存在复杂的相互作用。在健康人的肝脏，甘油三酯含量来自游离脂肪酸产生的脂肪组织。肝脏脂肪变性是胰岛素抵抗发展的重要预测因子，通常先于其它异常的发展，包括脂肪细胞肥大和肥胖发展、脂肪细胞死亡、巨噬细胞浸润和脂肪炎症。

肝脏是参与机体糖代谢的重要器官，GLUT2是肝细胞中最主要的葡萄糖转运体，主要通过胰岛素及其受体信号分子来调节葡萄糖在肝脏中的分布，产生作用，调节机体血糖。慢性游离脂肪酸升高则可能通过下调GLUT2 的表达及抑制胰岛素的生物合成，使对葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损[17]。而胰岛素的信号传递主要是通过IRS2 调控肝脏糖原的合成及葡萄糖的利用。在胰岛素信号传导中，IRS2 可激活下游一系列酶，将细胞外信号传递到细胞内。无论体内或体外的试验均证明，血液循环中游离脂肪酸对葡萄糖刺激的胰岛素分泌有重要的作用，游离脂肪酸的升高对葡萄糖诱导的胰岛素合成和释放起抑制作用。本文研究了肝脏中GLUT2 的表达，结果显示：高脂饮食组大鼠肝脏中GLUT2 的表达降低，表明游离脂肪酸合成增多，抑制了胰岛素的合成，引起糖脂质代谢紊乱。

本研究结果表明：EPP 在改善肥胖的同时，可明显抑制肥胖大鼠血糖增加和胰岛素抵抗，恢复肥胖大鼠肝脏功能和结构，这一保护作用可能与上调GLUT2、IRS2 的表达，影响糖脂代谢相关。

综上所述，EPP 对肥胖诱发的代谢紊乱有明显的改善作用，对肝脏损伤有显著抑制作用。