辛烯基琥珀酸酐酯化改性阿拉伯胶的工艺优化

石 燕，闫 薇，涂宗财，2*，胡月明

（1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌大学食品科学与工程系 南昌330047 2 江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室 南昌330022）

商业阿拉伯胶（Commercial gum arabic，CGA），主要是由非洲地区生长的金合欢属植物的枝和干自行渗出的黏稠状物，经过人工采集处理得到原始阿拉伯胶（Original gum arabic，OGA），再经过加工而制成的琥珀色干粉[1-2]。目前，CGA常被作为乳化剂、稳定剂及增稠剂，广泛应用在食品工业中[3-4]。乳化作用是CGA 最主要的作用。由于生长环境、树种等不可控因素的影响，CGA 的乳化性能并不稳定，真正具有商业价值的阿拉伯胶产品并不多，因此对CGA 进行改性，提高CGA的乳化性能，扩大其应用范围，成为当今研究的热点[5-6]。目前，对CGA 进行改性采用较多的是酯化改性，将疏水性的基团接入CGA 分子中来提高其乳化性能。Wang 等[5]通过十二烯基琥珀酸酐对CGA 进行改性，并通过乳液的粒径及稳定性来评价改性CGA 的乳化能力。Sarkar 等[7]采用干法，将95%乙醇稀释制备的OSA 溶液对CGA 进行酯化改性，表明改性的CGA 更适合作为微胶囊壁材。此外Shi 等[8]采用水相法，成功地利用OSA 对CGA 改性，结果改性后CGA 的乳化性能显著提高。目前的酯化改性方法均需添加大量的有机溶剂对OSA 进行预处理，在应用于工业化生产时对环境造成污染。本研究采用乳化剂（Emulsifying agent，EA）替代有机溶剂对OSA 进行预处理，可以大大减少由于有机溶剂造成的环境污染，同时选择OGA 为原料，将阿拉伯胶的提取、纯化、酯化一步完成，减少了生产工艺流程，更有利于工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

OGA，从树上采集的颗粒状原始阿拉伯胶，广州市千湖贸易有限公司；OSA（优级品），上海立德精细化工有限公司；乳化剂（食品级），武汉全康生物科技有限公司；火麻仁油（食品级），江西宏伟天然香料有限公司；甲醇和乙腈（色谱纯），美国TEDA 有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

快速打粉机（DF-400D），温岭市林大机械有限公司；高速分散机（ULTRA-TURRAX T25），德国IKA 公司；微射流（Microfluidizer Processor M-700），美国Microfluidics 公司；数显恒温水浴锅（HH-4），常州国华电器有限公司；数显精密增力电动搅拌器（JJ-1），江苏金林市环宇科学仪器厂；pH 计（DZG-6021P），瑞士梅特勒-托利多有限公司；喷雾干燥机（MDR.P-5），无锡市现代喷雾干燥设备有限公司；高效液相色谱仪（D-2000 HSM），日本Hitachi 公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet Nexus FT-IR），美国Thermo Nicolet 公司；激光粒度分布仪（BT-9300HT），丹东百特科技有限公司；马尔文电位仪（Zetasizer Nano ZSP），上海思百吉仪器系统有限公司；安东帕旋转流变仪，奥地利安东帕公司。

1.3 方法

1.3.1 OGA 的前处理 将OGA 放入快速粉碎机中粉碎（转速2 500 r/min，粉碎时间1 min），过100目筛，得到OGA 粉末。取质量为m 的OGA 粉末溶于蒸馏水，不断搅拌至溶解完全，过滤后保留OGA 溶液，备用。将不溶物烘干称重（m0），则溶液中OGA 粉末的质量m1=m-m0。

1.3.2 OSA 乳液的制备 称取一定量的EA，加到3%（以m1质量计）的OSA 中，加热至溶解完全，在高速剪切分散机的作用下缓慢将此混合物加入冰水中，形成预乳状液，经动态超高压微射流（压力40 MPa）处理2 次，形成乳状液，用冰水保存，备用。

1.3.3 OSA-GA 的制备 参考石燕等[9]的方法，用氢氧化钠调节OGA 溶液pH 值至8.85，然后将制备好的OSA 乳液在一定时间内分批缓慢加入OGA 溶液中。整个反应过程均采用氢氧化钠维持体系的pH 值，待反应完成时，用盐酸将体系的pH值调至6.00，将其喷雾干燥得到OSA-GA。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 OGA 质量分数对反应的影响 固定pH值8.85，反应时间1 h，反应温度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1质量计），改变OGA 的初始含量（30%，35%，40%，45%，50%），考察OGA 质量分数对反应的影响。

1.3.4.2 反应体系的pH 值对反应的影响 固定OGA 初始质量分数为40%，反应时间1 h，反应温度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1质量计），改变反应的pH 值（7.5，8.0，8.5，9.0，9.5），考察pH 值对反应的影响。

1.3.4.3 反应时间对反应的影响 固定OGA 初始质量分数为40%，反应pH 8.5，反应温度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1质量计），改变反应时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h），考察反应时间对反应的影响。

1.3.4.4 反应体系温度对反应的影响 固定OGA初始含量为40%，反应pH 8.5，反应时间1.5 h，OSA 乳液3%（以m1质量计），改变反应温度（15，25，35，45，55 ℃），考察反应温度对反应的影响。

1.3.5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 10.0 软件进行响应面试验设计，以OSA-GA 的接酯量为响应值，以反应体系pH（A），反应时间（B）和反应体系温度（C）为响应因素，做三因素三水平的响应面试验设计，中心试验重复3 次，共计17 个试验点，试验因素水平见表1。

表1 响应面分析法的因素与水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology

1.3.6 OSA-GA 接酯量的测定 参照Qiu 等[10]的方法，并稍作修改。色谱条件：色谱柱，Waters Nova-Pak C18 柱（3.9 nm×150 nm，4 μm）；流动相：乙腈-超纯水（体积比35∶65），流速：1.00 mL/min，进样量10 μL；检测器波长210 nm。

1.3.6.1 标准曲线的制作 精确称取1.000 g OSA，用乙腈定容至100 mL，得到质量浓度为10 mg/mL 的母液。取2.00 mL 母液于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容后不断振动使其水解36 h。分别取水解的母液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，乙腈定容后进行液相分析，得到标准曲线为Y=1020.5X-2.4131，R2= 0.9998，（X——OSA 的浓度（mg/mL）；Y——峰面积）。

1.3.6.2 接酯量的测定 总接酯量（OS）的测定方法：精确称取OSA-GA（M1，1.000 g），置于50 mL离心管中，向其加入20 mL 4 mol/L 氢氧化钠溶液，磁力搅拌24 h 以上，使其水解完全。将经氢氧化钠处理的2 mL 溶液置于25 mL 容量瓶中，向其中加入10 mL 1 mol/L 盐酸，用乙腈定容后进行HPLC 分析。总OS 的质量（Mtotal，g）由标准曲线和峰面积决定，总OS 质量与产物质量百分比（OStotal，%）的计算公式如下：

游离OS 的测定方法：精确称取OSA-GA（M2，0.5000 g）于50 mL 离心管中，向其加入5 mL 超纯水，磁力搅拌溶解完全，向离心管中加入10 mL 甲醇，混匀，5 000×g 离心5 min，取上清液1 mL，与1 mL 超纯水（pH 3）混合，进行液相分析，游离OS的质量（Mfree，g）由标准曲线和峰面积决定，游离OS 质量占产物质量百分比（OSfree，%）的计算公式如下：

1.3.7 红外光谱测定 采用无水乙醇将OSA-GA中部分残留的OSA 洗净后放在35 ℃烘箱中，干燥3 h 后，在红外灯下将样品与KBr 粉末混合并充分研磨，压片后将其置于红外光谱仪中扫描，扫描范围4 000～400 cm-1，利用红外软件对图谱进行分析[11]。

1.3.8 OSA-GA 乳液特性研究

1.3.8.1 乳化活力 分别称取3.0 g GA，EA-GA和OSA-GA，溶于蒸馏水中，配制质量分数为6%的溶液，在高速剪切分散乳化机的作用下缓慢向其中加入7.5 g 火麻仁油，转速为1 300 r/min，分散2 min，制备初级的乳液，然后使用动态超高压微射流处理初级乳液，压力为40 MPa，处理2 次。取30 μL 新鲜制备的乳液于25 mL 容量瓶中，用0.1%十二烷基磺酸钠定容，以0.1%十二烷基磺酸钠作为空白对照，采用紫外分光光度计测定乳液在500 nm 处的吸光度[12-13]。

1.3.8.2 乳液的稳定性 将制好的新鲜乳液置于10 mL 螺口瓶中，室温静置10 d，观察其分层情况，同时将稳定的乳液置于光学显微镜（目镜10×，物镜40×）下，观察储藏5 d 和10 d 的乳液颗粒的变化情况。

将新鲜乳液和室温下储藏5 d 和10 d 的乳液稀释2 000 倍，测定粒径和电位，确定乳液的稳定性[14]。

1.3.8.3 乳液的流变学特性 参照Huang 等[12]的方法并略加修改。采用带有60 nm 平板的MCR302流变仪对稳定的乳液进行流变学测定，剪切速率为0.1～100 s-1，测试温度25 ℃，分析乳液的表观黏度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 阿拉伯胶的质量分数对反应的影响 如图1所示，随着OGA 质量分数的增加，酯化反应的程度呈先增加后减小的趋势，当OGA 含量为40%的时候，反应程度达到最大。这是由于整个反应体系中可能存在酯化和水解2 种反应，OGA 质量分数越低，与OSA 接触的几率越小，不利于酯化反应的快速进行，且OSA 的水解程度将增加，因此随着其质量分数的增大，反应程度加强[5]。当OGA浓度增到一定程度时，整个反应体系黏度增加，导致搅拌困难，OSA 难以扩散，不利于酯化反应的进行，导致反应程度降低[15]，选择OGA 的初始含量为40%。

图1 阿拉伯胶质量分数对反应的影响Fig.1 Effect of the mass fraction of gum arabic on the extent of reaction

图2 反应体系pH 值对反应程度的影响Fig.2 Effect of the pH on the extent of reaction

2.1.2 反应体系pH 值对反应的影响 如图2所示，随着反应体系pH 值的增大，反应程度提高，当pH 8.5 时，反应程度最大；pH 值继续增加，反应程度降低。究其原因：在酯化反应中，OGA 分子中的羟基是参与反应的活化中心，在弱碱性条件下，OGA 分子被解离成阴离子，该阴离子易与带有正电荷的OSA 的羰基碳发生亲核取代反应，生成OSA-GA，当pH 值较低时，会降低分子解离的速率，不利于OGA 分子中的羟基与OSA 的羰基碳的亲核反应，造成酯化反应速率降低。当pH 值过高时，OSA 易与强碱发生反应，生成羧酸氢钠，降低其与OGA 的反应活性，从而影响酯化反应的程度[7，16]。酯化反应的最佳pH 值为8.5。

2.1.3 反应时间对反应的影响 随着反应时间的增加，反应程度呈现先提高后降低的趋势（图3）。这可能是由于酯化反应是一个存在酯化和水解2种反应的可逆反应，在初始阶段，酯化反应比水解反应快，酯化反应占据主导地位，且反应时间延长增加了OSA 与OGA 接触的机会，反应程度提高。随着反应时间的延长，酯化反应的产物质量分数增大，水解反应速率加快，导致酯化程度下降。最终选择反应时间为1.5 h。

2.1.4 反应体系温度对反应的影响 如图4所示，反应程度随反应温度的增加呈先上升后下降的趋势，当反应温度25 ℃时，反应程度最大。温度对酯化反应程度的影响是多方面的：一方面反应温度过低，不利于解离的OGA 分子与OSA 分子接触，同时也不能提供足够的能量使该反应顺利进行，从而导致反应速率降低。另一方面，温度升高到一定值后，酯化产物和OSA 的水解程度增大，使反应程度降低。最终选择反应温度为25 ℃。

图3 反应时间对反应程度的影响Fig.3 Effect of reaction time on the extent of reaction

图4 反应体系的温度对反应程度的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the extent of reaction

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计结果与方差分析 利用Design-Expert 10.0 软件的Box-Behnken 设计，建立反应体系pH、反应温度和反应时间三因子回归模型方程式为：

表2 Box-Behnken 试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

（续表2）

OS（%）=1.99+0.00625A+0.022B-0.089C+0.035AB+0.017AC+0.035BC-0.072A2-0.069B2-0.19C2。

由表3 可知，该模型的回归项极显著（P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.4196＞0.05），决定系数R2=0.9739，说明酯化反应的取代度与模型预测结果有较高的一致性。模型的校正系数R2Adj=0.9404，说明试验结果中94.04%受试验因素的影响，可用该模型分析与预测对OSA-GA 工艺。由回归方程和方差分析，各因素对酯化反应影响的顺序为C（反应温度）＞B（反应时间）＞A（反应pH）。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 各因素的交互效应分析 回归分析结果的响应面及其等高线如图5所示。响应面是响应值与各试验变量因素之间的函数关系式，考虑了两两因素交互作用对试验结果的影响。响应面曲面坡度的陡峭和等高线的形状可反映交互作用的强弱趋势[17-18]。

由图5a 可知，反应体系的pH 值和反应时间的交互作用对响应值影响不十分显著，当反应pH值一定时，反应时间延长使酯化反应的接酯量呈先上升后下降的趋势，影响显著；当反应时间一定时，反应pH 值对酯化反应的接酯量影响不大，仅在pH 值较低时存在响应。同理，分析图5c 和5e，得出交互项对酯化反应的影响：各因素的交互作用均不显著，然而，固定反应pH 值或反应时间，分析反应温度，得出随着反应温度的升高，酯化反应的接酯量呈先上升后下降的趋势，影响较显著，这与方差分析结果一致。由工艺优化试验得到预测的OSA-GA 最佳工艺条件为：反应pH 8.52，反应时间1.56 h，反应温度22.8 ℃，预测产品的接酯量为2.00%。考虑实际操作情况，将最佳工艺条件调整为反应pH 8.5，反应时间1.56 h，反应温度23℃。以调整的最佳合成工艺对OGA 进行改性，对工艺进行验证，得到产物的接酯量为1.97%，与理论值2.00%相比，相对误差为1.5%。说明建立的模型能很好地预测OSA-GA 的接酯量，优化工艺较可靠。

图5 各因素的交互作用对酯化反应影响的响应面及等高线Fig.5 Response Surface and contour lines of the interaction of various factors on esterification reaction

2.3 红外光谱的测定

原始阿拉伯胶经预处理直接喷雾干燥得到GA，经相同改性的乳化剂——阿拉伯胶（Emulsifying agent-gum arabic，EA-GA）及OSA-GA 的红外光谱图如图6所示。三者具有相似的特征图谱。在波数3 420 cm-1处出现大而宽的吸收峰，是GA 分子中的-OH（-NH）键的缔合伸缩振动；2 930 cm-1处的为GA 分子中的亚甲基-CH 伸缩振动引起的吸收峰，在波数2 200 cm-1处的为空气中CO2的吸收峰，1 600 cm-1处为-N-H 平面弯曲振动引起的[19]。与未改性的GA 和EA-GA 相比，酯化改性产物OSA-GA 红外谱图的最大变化是：在1 724 cm-1处出现新的特征峰，这是酯键（-COOR）的羰基伸缩振动吸收峰[20]，表明OSA-GA 分子中酯羰基的存在[21]，OSA 成功接枝到GA 分子中。

图6 改性前、后阿拉伯胶的红外光谱图Fig.6 FTIR spectra of gum arabic before and after modification

2.4 乳液特性分析

2.4.1 乳化活力 三者的乳化活力如图7所示，与GA 相比，EA-GA 的乳化活力有一定的提高，这可能由于EA 是一种亲油型的乳化剂，它的加入，提高了对油相的亲和力，从而提高其乳化活力。二者没有显著性差异，这与石燕等[9]的研究结果不完全一致，可能是因为该改性方法所需反应温度较低，不能引起GA 发生“熟化”作用[22]。相对于GA 和EA-GA，OSA-GA 的乳化性能得到明显的提高，这因为GA 经酯化反应后，OSA 分子中疏水和亲油双功能基团的接入使其对水和油的亲和力增强，从而提高其乳化活力[23-24]。

2.4.2 储存时间对乳液粒径和电位的影响 储存时间对各个乳液的粒径和电位的影响见表4。不同的乳液呈现不同的粒径和电位值。储存期间，OSA-GA 表现出最小的粒径和电位值，这可能因为OSA 分子中的两性基团能够促进OSA-GA 形成较好的亲水性-疏水性平衡，在液滴周围形成稳定的薄膜，且OSA 分子的接入使油滴颗粒之间产生更大的空间位阻，从而提高其乳化稳定性[5，25]。酯化反应引入部分正电荷的OSA，从而降低了其电位值。

图7 GA、EA-GA 和OSA-GA 的乳化活力Fig.7 Emulsiying activity of GA，EA-GA and OSA-GA

表4 储存时间对乳液粒径和电位的影响Table 4 Effect of storage time on particle size and ζ-potential of emulsion

2.4.3 储存时间对乳液微观结构的影响 通过光学显微镜观察储存时间对乳液微观结构的影响，从微观角度分析酯化改性对GA 乳液稳定性的影响。通过观察螺母瓶中静置的乳液，发现GA 和EA-GA 乳液分别在第1 天和第6 天出现分层现象。同时将未分层的乳液置于显微镜下观察，结果如图8所示，整个储存过程中OSA-GA 乳液液滴最稳定，视野范围内未出现乳液聚集现象，表现出较好的稳定性，这也与粒径和电位的结果类似。可能是因为OSA-GA 分子中疏水烷基和亲水羧基的接入可以吸附在液滴表面，通过空间位阻效应阻碍液滴的聚集[7]，进而使乳液稳定。综上表明，采用OSA 对GA 进行酯化改性，能够提高GA 的乳化稳定性。

图8 储存时间对乳液微观结构的影响Fig.8 Effect of storage time on the microstructure of emulsion

2.4.4 储存时间对乳液表观黏度的影响 如图9所示，酯化改性的OSA-GA 乳液与GA 和EA-GA乳液的流变学行为相似，随着剪切速率的增加，所有的乳液黏度均逐渐降低，表现为剪切稀释。GA溶液的流变学行为主要与较大分子组分的阿拉伯半乳聚糖蛋白分子聚集密切相关[1]。在新制备的乳液中，EA-GA 乳液的表观黏度高于GA 乳液，这可能是由乳化剂的加入导致GA 分子中的阿拉伯半乳聚糖蛋白分子的尺寸发生变化[26]。与GA 和EA-GA 乳液相比，OSA-GA 乳液的表观黏度明显较高，这可能是由于OSA 分子的接入使GA 的分子质量增加，抑制了OSA-GA 分子的运动，且亲水的羧酸基团的引入，使得其与水分子之间的作用力增强，因此表观黏度增加[8，27]。

3 结论

以OGA 为原料，采用乳化剂对OSA 进行预处理，在单因素试验基础上，选择反应体系pH值、反应时间和反应温度进行响应面分析的数据拟合，得到OSA-GA 的最佳合成工艺条件为：反应pH 8.5，反应时间1.56 h，反应温度23 ℃。在此工艺条件下，OSA-GA 的接酯量为1.97%。红外光谱结果分析表明：OSA 分子成功接入OGA 中。对比阿拉伯胶，结合粒径、电位以及微观结构数据，发现较高的表观黏度有利于避免乳液中颗粒的聚集及分层，经酯化改性的OSA-GA 乳化性能显著提高。这种基于乳化剂替代有机溶剂的酯化改性方法，不仅提高了阿拉伯胶的乳化性能，扩大了其应用范围，而且避免了因有机溶剂的使用而造成的环境污染。对原始阿拉伯胶进行提取、提纯、酯化一步完成，减少了生产工艺流程，节约了生产成本。

图9 储存时间对乳液表观黏度的影响Fig.9 Effect of storage time on the viscosity of emulsion