基于1，2-二氯乙烷体系的金枪鱼副产物中脂质提取与组学分析

崔益玮，赵巧灵，俞喜娜，周小敏，马永钧，陈 康，戴志远，王萍亚，沈清*

（1 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 舟山市食品药品检验检测研究院 浙江舟山316000 3 浙江兴业集团有限公司 浙江舟山316101）

金枪鱼因高营养、高食用价值的特点而备受全世界范围消费者的喜爱。联合国粮食及农业组织在2017年发布的报告中指出：2015年全球养殖金枪鱼产量达到36 827 t[1]。近几年，世界金枪鱼年产量稳定在400 万t 左右，产值达300 多亿美元，已成为我国海产品的主要补充和加工出口的主要品种[2]。然而，金枪鱼的食用部分仅占其总质量的50%～70%，金枪鱼加工业产生的大量如内脏等加工副产物常被作为饲料或直接丢弃，造成资源浪费和环境负担[3]。

金枪鱼脂肪中富含功能性油脂，如磷脂、甘油酯等。磷脂是一类含有磷酸根脂质的总称，主要存在于动物体的脑、肝脏、卵巢等多种器官中[4-5]，它是组成生物体的重要活性成分[6]，能够促进动物生长发育，提高免疫力[7]，促进酯类消化吸收，调节血脂，降低血液胆固醇[8]。海洋生物的磷脂因极性官能团和sn-1/2 位上连接的脂肪酸不同而存在若干种结构相似的磷脂分子亚类[9]。除常见的油酸链（C18：1）、亚油酸链（C18：2）、亚麻酸链（C18：3）外，多数还含有二十碳五烯酸链（C20：5，EPA）、二十二碳五烯酸链（C22：5，DPA）和二十二碳六烯酸链（C22：6，DHA）[10-13]等ω-3 多不饱和脂肪酸链，这种含有ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂兼具磷脂和ω-3 多不饱和脂肪酸的生理功能。金枪鱼鱼油与普通鱼油最大的区别在于它富含ω-3 多不饱和脂肪酸，这是一种人体不可缺少且自身又不能合成的重要营养元素，有调节免疫[14]，健脑明目[15-16]，抗炎、抗癌[17-18]，预防和治疗心脑血管疾病[19]等多种生理功能。

目前，常用的脂质提取方法有溶剂萃取法、超临界CO2萃取法和固相萃取法，其中溶剂萃取法因普遍可得到纯度较高的磷脂且对设备及投资要求较低而得到广泛的应用。目前较常用的溶剂萃取法主要为Bligh & Dyer 法和乙醇浸提法[20]。陈康等[21]利用超声辅助Bligh & Dyer 脂质提取法提取南极磷虾中磷脂；邹舟等[22]利用Bligh & Dyer法提取鲢鱼各部位组织中的磷脂；Price 等[23]通过探索不同的提取条件，得出用70%乙醇于70 ℃下提取是得到乳制品中磷脂的最佳条件。然而，上述方法或使用毒性较强的试剂作为溶剂而不适用于食品工业，又或方法提取效率低而达不到预期效果。

1，2-二氯乙烷（1，2-dichloroethane，1，2-DCE）在国家标准中被列为食品添加剂和食品加工助剂而允许用于某些食品加工过程中[24-25]。因其化学性质与氯仿相似，故本研究基于1，2-DCE 体系结合丙酮沉淀法建立同时提取金枪鱼内脏中的磷脂和鱼油的方法。此方法将适用于食品加工工业，并有利于对金枪鱼副产物的合理利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

急冻金枪鱼，宁波市象山县渔家海味自营店。37 种脂肪酸甲酯混标标准品（纯品），上海安谱实验科技股份有限公司；磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyleth-anolamine，PE）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）4 类标准品（纯度97%），美国Avanti Polar Lipids 公司；甲醇、乙腈（色谱纯），德国Merck 公司；甲酸、甲酸铵（色谱纯），美国Tedia 公司；1，2-DCE、氯仿、丙酮、乙醇、KCl 等（均为分析纯），国药试剂公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（Acquity），美国Waters 公司；串联四极杆质谱配ESI 离子源（4000 QTRAP），美国AB Sciex 公司；气相色谱仪（7890A），美国Agilent公司；高速冷冻离心机（落地式），美国Thermo 公司；超纯水系统，法国Milli-Q 公司；其它为实验室常用仪器和设备。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 急冻金枪鱼（Thunnus thynnus）解冻1 h 后取其内脏，打碎、匀浆，置于-20 ℃冰箱中贮藏，备用。该过程于2 h 内完成。

1.3.2 脂质混合物的提取

1）1，2 -DCE/甲醇法提取脂质混合物 精密称定金枪鱼副产物样品10.00 g，加入1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）混合液40 mL 振荡混匀，加入10 mL超纯水，以10 000 r/min 高速冷冻离心10 min。使用移液器转移下层清液，向余下的上清液和固形物中加入与第1 次提取时等体积的1，2-DCE，进行二次提取。根据上述操作重复提取2 次。称取圆底烧瓶空瓶质量，将合并的下清液移入瓶中，使用旋转蒸发仪65 ℃蒸发1，2-DCE，再次称取该瓶质量并与之前质量相减即提取所得脂质混合物（包括磷脂、游离脂肪酸、甘油酯等脂质）质量。

2）1，2 -DCE 法提取脂质混合物 以1，2-DCE 替代上述1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）混合液，其余步骤同1，2-DCE/甲醇法。

3）Bligh & Dyer 法提取脂质混合物 精密称取副产物样品10.00 g，加入10 mL 氯仿及20 mL 甲醇，磁力搅拌20 min，抽滤后收集滤液。向残渣中加入10 mL 氯仿，磁力搅拌20 min 并抽滤，重复该步骤2 次。合并3 次提取所得滤液，在其中加10 mL 0.88% KCl 溶液，混匀后倒入分液漏斗，静置分层3 h。取下层氯仿层于已称量的圆底烧瓶空瓶中，使用旋转蒸发仪60 ℃蒸除氯仿，再次称取该瓶质量，与之前质量相减即提取所得脂质混合物质量。

4）乙醇浸提法提取脂质混合物 精密称取副产物样品10.00 g，加入95%乙醇150 mL，振荡混匀后置水浴锅中，45 ℃提取4 h 后抽滤。将滤液收集至称量后的圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在65 ℃使乙醇和水充分蒸发，再次称取该瓶质量，与之前质量相减即提取所得脂质混合物质量。

1.3.3 磷脂和鱼油的分离纯化及得率计算 待脂质混合物冷却后在其中加入预冷的丙酮100 mL，振荡萃取后移入称量的离心管中，以8 000 r/min高速冷冻离心6 min，移出上清液，将沉淀用氮吹仪吹干后再次称量，减去空管质量即磷脂质量。使用旋转蒸发仪35 ℃蒸除使上清液中的丙酮，再次称量旋转蒸发瓶，减去空瓶质量即鱼油（包括游离脂肪酸、甘油酯等脂质，下同）的质量。

按磷脂得率计算公式：

1.3.4 脂肪酸甲酯化 将0.1 g 鱼油与2 mL 0.5 mol/L NaOH-MeOH 溶液混合后振荡摇匀，在65℃水浴锅中加热30 min，取出后冷却至室温。加入2 mL BF3-MeOH 溶液，振荡混匀，在65 ℃水浴锅中继续加热3 min，取出并冷却至室温，加入2 mL 正己烷提取，同时加入2 mL 饱和NaCl 溶液水洗。取出上清液，在其中加入1/10 体积无水硫酸钠去除溶液中痕量的水，取上清液用于气相色谱分析。

1.3.5 气相色谱条件 色谱柱：HP-88 毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.2 μm）；载气：高纯氮气；恒流：0.65 mL/min；进样量：1 μL；分流比：40∶1；进样口温度：250 ℃；升温程序：初温50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至220 ℃维持15 min。

1.3.6 液相色谱条件 色谱柱：COSMOSIL HILIC柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A：含有0.1%甲酸的乙腈溶液；流动相B：含有20 mmol/L 的甲酸铵和0.1%甲酸的水溶液；流动相流速：200 μL/min。进样量：2 μL；梯度洗脱程序：0～3 min，维持95%流动相A；3～13 min，将流动相A 从95%降到70%；13～18 min，将流动相A 从70%降到50%；18～23 min，维持50%流动相A；23～24 min，将流动相A 从50%升到95%；24～32 min，维持95%流动相A。

1.3.7 质谱条件 负离子模式检测；扫描范围：450～950 Da；去簇电压60 V；聚焦电势200 V；离子源电压4 500 V；去簇电势10 V；气源1：344.7 kPa；气源2：413.7 kPa；气帘气：172.4 kPa；脱溶剂温度500 ℃；子离子扫描碰撞能30 V。

1.3.8 数据处理分析 试验所得3 组平行数据用SPSS 23.0 进行标准差分析，用Origin 软件作图。气相色谱使用归一化法定量分析，质谱数据采集与分析采用Analyst 1.5 数据处理系统。

2 结果与讨论

2.1 优化的金枪鱼内脏磷脂和鱼油提取条件

分别用1，2-DCE/甲醇法、1，2-DCE 法、Bligh& Dyer 法、乙醇浸提法同时提取金枪鱼内脏磷脂和鱼油。其中，将1，2-DCE/甲醇法中的1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）混合液换成总体积相同的1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）混合液和1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）混合液分别提取，所得结果见图1。

在磷脂提取方面，6 种提取方法对金枪鱼内脏的磷脂得率分别为（0.944±0.071）%，（0.643±0.080）%，（0.468 ± 0.083）%，（0.313 ± 0.026）%，（1.331 ± 0.074）%，（0.275 ± 0.072）%。其中1，2-DCE/甲醇法的提取率随萃取混合液中1，2-DCE比例的增加而下降，当萃取混合液的比例为1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）时，该方法提取金枪鱼内脏的磷脂得率最高，1，2-DCE 法的磷脂得率则最低。其原因可能在于甲醇极性高于1，2-DCE，而磷脂又为极性分子，因此提高甲醇比例有利于磷脂提取[26]。同时，使用不同溶剂将样品组织中结合态脂类游离出来时，因氯仿相较于1，2-DCE 极性更高，与磷脂等极性脂类的亲和性大，故Bligh &Dyer 法对磷脂的得率相较于1，2-DCE/甲醇法和1，2-DCE 法高。以Bligh & Dyer 法为基准计算1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法的提取率为70.9%。比较而言，氯仿不适用于食品加工业。考虑到安全性，1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法在实际应用中更具优势。乙醇浸提法提取金枪鱼内脏磷脂的得率也很低，可能是由于乙醇浸提法也被用于蛋白质提取[27]，在提取过程中易在磷脂中混入蛋白质，而蛋白质同样不溶于丙酮[28]，用丙酮沉淀法无法去除，因此对得率有一定影响。

在鱼油提取方面，6 种提取方法的金枪鱼内脏鱼油的得率分别为（17.306±0.571）%，（17.663±0.616）%，（18.281±1.002）%，（16.693 ± 0.675）%，（15.299±0.694）%，（16.267±0.898）%。1，2-DCE/甲醇法的得率随萃取混合液中1，2-DCE 比例的增加而增加，其中1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法提取金枪鱼内脏鱼油的得率最高，也高于Bligh &Dyer 法。以1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法为基准计算鱼油的提取率为94.7%。综上所述，在磷脂与鱼油的提取方面，1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法为较优。1，2-DCE 法和乙醇浸提法的金枪鱼内脏磷脂和鱼油得率均较低，因此不对其进行后续脂质组学分析。

图1 不同提取方法对金枪鱼内脏磷脂得率的影响Fig.1 Effect of different extraction methods on the extraction rate of phospholipids from tuna guts

2.2 鱼油样品中脂肪酸化学成分分析

对1，2-DCE/甲醇法、Bligh & Dyer 法提取所得金枪鱼内脏鱼油进行脂肪酸甲酯化试验，然后采用气相色谱法分析其脂肪酸组成，结果见表1。

表1 鱼油中脂肪酸甲酯化学组分及含量Table 1 The chemical constituent and content of fatty acid methyl ester（FAME）in the fish oil

结果显示，在上述方法提取所得金枪鱼内脏鱼油中共检出18 种脂肪酸，其组成基本一致。饱和脂肪酸中，以棕榈酸为主，硬脂酸次之；单不饱和脂肪酸中，以油酸为主，棕榈油酸次之；多不饱和脂肪酸中，以DHA 为主，EPA 次之。各方法提取的金枪鱼内脏鱼油中，不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的64.028%～64.891%，多不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸含量的35.929%～36.993%，EPA 与DHA 总含量占总脂肪酸含量的30.787%～32.522%，说明1，2-DCE/甲醇法对不饱和脂肪酸的提取效果与Bligh & Dyer 法相同，且1，2-DCE/甲醇法在EPA 与DHA 的提取上更优于Bligh &Dyer 法。

2.3 液相色谱-质谱法脂质组学鉴定

对比磷脂标准品液相色谱图（图2）和样品液相色谱图（图3）可知金枪鱼内脏磷脂样品中所含磷脂种类。

因磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol，PG）一般不存在于动物骨骼肌组织中，磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）在海洋生物组织中属低丰度磷脂，故这2 类磷脂均未检出，该结果与Shen 等[29]的结论一致。标准品中PC 的出峰时间为10.42 min（图2a），对比可得，样品中9.74 min 的峰即PC（图3）。同理，图3 中出峰时间为11.02 min 的峰为PE，出峰时间为16.13 min 的峰为PI，出峰时间为17.34 min 的峰为PS。继而可得到每类磷脂分子所包含的分子种类（图4）。

图2 磷脂标准品液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of phospholipid standards

图3 样品液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of the sample

由图4 可知，该磷脂样品中，PC 和PE 2 类磷脂分子检测图谱出峰数量较多，PI 类磷脂分子检测图谱出峰数量次之，PS 类磷脂分子检测图谱出峰数量为4 类中最少。其中，PC 类多集中在m/z764.9～879.0，m/z 778.9、m/z 805.0、m/z 850.9 等峰丰度较大；PE 类多集中在m/z 736.9～790.9，m/z 762.9、m/z 775.0、m/z 790.9 等峰丰度较大；PI 类m/z 多集中在857.9～910.0，m/z 884.0、m/z 886.0等峰丰度较大；PS 类多集中在m/z 806.9～862.7，m/z 834.9、m/z 836.9 等峰丰度较大。

待磷脂分子种类确定后，本试验用多维质谱法得到所有含有选定脂肪酸链碎片的磷脂，与图4 对比后由LipidViewTM 软件定性和多维质谱解析，并通过归一化法对已鉴定的磷脂分子进行相对含量测定。其它几种提取方法所得磷脂样品分析方法同上。由表2 可知，在对金枪鱼内脏磷脂组成的检测中，除1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法所提取的磷脂在PS 亚类磷脂的种类上缺少CO-18：0/C22：5和C20：0/C22：6外，4 种提取方法对金枪鱼内脏磷脂的提取在磷脂种类上基本一致，即共检出16 种PC，14 种PE，11 种PI，12 种PS。其中，磷脂的C原子总数为32～42，总双键数为0～7。这4 类磷脂中，PC 亚类C16：0/C18：1（13.218%～19.897%）、C16：0/C22：6& C18：1/C20：5（11.135%～14.801%）、C16：0/C16：0（7.450%～18.558%）等分子种含量较高；PE 亚类中CO-18：1/C22：6（9.838% ～16.239% ）、C18：0/C22：6（11.687% ～13.653%）、C18：1/C20：5（10.048%～13.418%）等分子种含量较高；PI 亚类中 C16：0/C22：4& C18：0/C20：4（47.773%～62.160%）、C16：0/C22：5& C18：0/C20：5（18.672%～24.763%）、等分子种含量较高；PS 亚类中C18：0/C22：6（33.917%～42.381%）、C18：0/C22：5（15.694%～18.231%）、C16：0/C22：4& C18：0/C20：4（6.817%～11.018%）、C16：0/C22：6&C18：1/C20：5（6.352%～10.727%）等分子种含量较高。

图4 样品磷脂质谱图Fig.4 Mass spectrum of sample phospholipids

上述4 种提取方法所得各类金枪鱼内脏磷脂的脂肪酸链中均存在许多不饱和脂肪酸链，甚至较多ω-3 多不饱和脂肪酸链。各方法提取所得包含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂种类组成几乎一致，其中含量较高的有PC 中的C16：0/C22：6& C18：1/C20：5、C18：0/C22：6等分子种；PE 中的CO-18：1/C20：5、CO-18：0/C20：5、C18：1/C20：5、C18：0/C20：5、CO-18：1/C22：6、CO-18：0/C22：6、C18：0/C22：6等分子种；PI 中的C16：0/C22：5& C18：0/C20：5等分子种；PS 中的C16：0/C22：6& CO-18：1/C20：5、C18：0/C22：6、C18：0/C22：5等分子种。虽然磷脂种类相同，但是不同提取方法得到的含有这类脂肪酸链的磷脂含量却有所差别（图5）。

图5 金枪鱼内脏磷脂ω-3 多不饱和脂肪酸链相对丰度Fig.5 Relative abundance of ω-3 polyunsaturated fatty acid chains in tuna guts phospholipids

如图5所示，在对PC 类磷脂的提取中，1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法得到的包含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂含量最高（51.210%±5.074%），其次是1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法（45.857% ±5.151%），最低的为Bligh & Dyer 法（37.010% ±4.485%）；在对PE 类磷脂的提取中，1，2-DCE/甲

醇（1∶2，V/V）法得到的包含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂含量最高（71.319% ± 7.148%），其次是1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法（68.699%± 6.709%），最低的为1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法（56.606%±6.310%）；在对PI 类磷脂的提取中，1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法得到的包含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂含量最高（34.349% ± 3.814%），其次是1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法（34.090%±4.010%），最低的为Bligh & Dyer 法（25.300%±3.162%）；在对PS 类磷脂的提取中，1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法得到的包含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂含量最高（80.598%±8.526%），其次是1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法（75.205% ± 8.407%），最低的为1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法（70.242% ±7.167%）。可以看出，在提取金枪鱼内脏中含ω-3多不饱和脂肪酸链磷脂方面，虽然在磷脂种类组成上各方法差异很小，甚至几乎相同，所得结果也与已有报道相类似[30-31]，但是在提取量上1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法和1，2-DCE/甲醇（1∶1，V/V）法对4 类磷脂的提取量均明显优于Bligh & Dyer法和1，2-DCE/甲醇（2∶1，V/V）法，表明1，2-DCE/甲醇法不仅可以提取金枪鱼内脏中的磷脂，还可以提取其中含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂。

表2 金枪鱼内脏磷脂相对丰度及结构Table 2 Relative abundances and chemical structures of tuna visceral phospholipids

（续表2）

3 结论

目前金枪鱼副产物中脂质的提取方法或因试剂毒性较大不适宜用于食品工业，或存在分离度低、操作繁琐等缺点。本方法基于相对更为安全的1，2-DCE 体系结合丙酮沉淀法，建立了同时提取金枪鱼内脏中的磷脂和鱼油的方法，并对其进行优化，得到最佳提取方法为1，2-DCE/甲醇（1∶2，V/V）法，磷脂和鱼油的得率分别为（0.944 ±0.071）%和（17.306±0.571）%。通过对该方法提取所得鱼油样品进行脂肪酸链分析，发现金枪鱼内脏鱼油中多不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸含量的36.678%，其中EPA 与DHA 之和达32.256%。所得磷脂样品中共检测出53 种磷脂分子，含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂所占比例较高。试验结果说明该方法不仅能够高质量地提取金枪鱼内脏中的不饱和脂肪酸，还可有效制备富含ω-3 多不饱和脂肪酸链的磷脂。通过利用1，2-DCE 在食品加工中的相对安全性，不仅开发了更安全、更适用于食品加工工业的提取方法，同时也对金枪鱼副产物进行了更加合理的开发利用，达到了保护生态环境的目的。