基于血糖仪设计检测甲基对硫磷的便携式传感器

周津 王代芳

摘 要：利用磁珠的分离与富集作用，以血糖仪为检测器，建立一种检测甲基对硫磷的便携式传感器。结果显示：在1～316 nmol/L范围内血糖仪信号减弱值与目标浓度的对数值呈良好的线性关系，检测限为1 nmol/L。该传感器便携可行，灵敏度高，重复性好，为有机磷农药甲基对硫磷的筛查提供了一种新方法。

关键词：磁珠;血糖仪;有机磷农药甲基对硫磷

中图分类号：X832;TP212 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2021）19-0037-03

Abstract： Based on the separation and enrichment of magnetic beads， a portable sensor was developed for the determination of Methyl Parathion by blood glucose meter. The results showed a good linear relationship in the range of 1～316 nmol/L， with a detection limit of 1 nmol/L. The sensor is portable， feasible， high sensitivity and good repeatability. It provides a new method for the screening of organophosphorus pesticide methyl parathion.

Keywords： PMPs;personal glucose meters;parathion methyl

有机磷农药甲基对硫磷在农业生产中的广泛使用，导致农作物中存在不同程度的农药残留[1]。目前，常规的检测方法[2-4]多使用气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法以及液相色谱-质谱法等，需要专门的仪器设备及标准品，对技术要求较高、检测周期较长、检测成本较高，不适合现场快速检测及大批量样品的快速筛查。血糖仪具有体积小便携、检测成本低、定量準确以及操作简便等优点，是比较成功的便携式仪器[5]。本文以磁珠作为信号放大系统，血糖仪作为检测器，构建一种快速筛查有机磷农药甲基对硫磷的便携式传感器。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂。蔗糖（阿尔法埃莎中国有限公司）;Sulfo-SMCC、TCEP、蔗糖转化酶和吐温-20（西格玛奥德里奇贸易有限公司）;磷酸二氢钠和磷酸氢二钠（分析纯，上海化学试剂公司）;链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子（SA-PMPs）（美国普洛麦格公司）;本实验用水为18.2 MΩ的超纯水。

DNA均由上海生工生物技术有限公司合成及纯化（中国上海），序列如下（从左到右：5’到3’）：

3’-生物素修饰的捕获DNA：

ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGCGTGGTGGCTGTAGATAGTAAGTGCAATCTAAAAAAAAA-Biotin

3’-巯基修饰的信号DNA：

TGAATAAGCTGGTATAAAAAA-SH

1.1.2 仪器。Milli-Q超纯水系统（Millipore，Bedford，USA）;PHS-3C型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）;FINNPIPETTE可调式移液器（上海热电仪器有限公司）;TGL-16型台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）;罗氏罗康全血糖仪及其配套试纸Roche ACCU-CHEK® Active罗氏罗康全活力2型（德国罗氏诊断产品有限公司）。

1.1.3 溶液的配制。缓冲溶液A：0.1 mol/L氯化钠，0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.4，0.05%的吐温-20;缓冲溶液B：0.1 mol/L氯化钠，0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH为7.4;蔗糖溶液：1.0 mol/L的蔗糖溶液用缓冲溶液A配制并储存于4 ℃待用。

1.2 方法

1.2.1 捕获探针（CP-PMPs）的制备。首先移取0.6 mL浓度为1 mg/mL的修饰有链霉亲和素的磁珠（SA-PMPs），用缓冲溶液B洗涤3次后重新溶解于0.6 mL的缓冲溶液B中。加入生物素修饰的捕获DNA[6]并将混合物置于摇床上在室温振荡1 h，然后用缓冲溶液B洗涤磁珠3次并溶解于适量缓冲溶液B中，配制成终浓度为20 μmol/L的捕获探针母液（CP-PMPs）。由于链霉亲和素和生物素之间具有强亲和力的特异性结合作用[7]，因此修饰有生物素的捕获DNA能被固定结合在修饰有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs表面。随后，用磁铁吸附混合溶液中捕获DNA与SA-PMPs反应所生成的磁珠复合物，并进一步用缓冲溶液B洗涤此磁珠复合物3次。最后，将洗涤后的磁珠复合物重新分散于缓冲溶液B中并储存于4 ℃待用。

1.2.2 信号探针（SP-酶）的制备。根据文献报道的方法[8]合成蔗糖转化酶标记的信号探针（SP-invertase）。制备步骤简述如下：首先，移取30 μL浓度为100 μmol/L的巯基修饰的信号DNA溶解于超纯水;其次，加入2 μL浓度为3 mmol/L的TCEP和20 μL的pH为5.5、浓度为10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，将混合溶液在室温下反应1 h;最后，将反应混合物用缓冲溶液A透析得到活化后巯基修饰的信号DNA。为了使蔗糖转化酶键合到信号DNA上，移取800 μL浓度为10 mg/mL的蔗糖转化酶溶液，并称取1 mg的Sulfo-SMCC同时加入缓冲溶液B中，将其混合并涡旋5 min后，将混合物置于摇床上在室温下振荡1 h。随后用离心机进行离心分离，除去未溶解的Sulfo-SMCC。取上清液中用Sulfo-SMCC修饰后的蔗糖转化酶溶液与上述活化后的信号DNA在室温下混合孵化48 h。为了移去未反应的信号DNA，将混合溶液用缓冲溶液A透析得到纯化后的信号探针（SP-invertase）。

1.2.3 目标物的检测。取适量信号探针（SP-invertase）和捕获探针（CP-PMPs）加入缓冲溶液B（pH为7.4）中，配成捕获探针和信号探针终浓度为4 μmol/L、总体积为30 μL的测试溶液。在体系中，捕获探针与信号探针首先组装形成蔗糖转化酶标记的DNA-PMPs。在没有目标物甲基对硫磷存在的条件下，蔗糖转化酶直接组装到磁珠上，用磁铁分离出体系中的磁珠-蔗糖转化酶复合物。使用50 μL缓冲溶液B进一步洗涤固定在磁珠表面的蔗糖转化酶复合物3次，并将其最终溶解于10 μL的缓冲溶液B中，然后向上述溶液中小心加入20 μL浓度为1.0 mol/L的蔗糖溶液，并在室温下孵化20 min。体系中蔗糖转化酶催化蔗糖水解生成葡萄糖，并能被血糖仪检测到。此时，检测到的血糖仪信号高，同时可观察到血糖试纸背面的比色窗口颜色发生明显的变化。当体系中加入不同浓度的目标物甲基对硫磷并在黑暗处于室温条件下孵化1 h后，目标物与捕获探针之间发生强有力的特异性结合，同时将信号探针从捕获探针上解离下来。相同方法操作后，检测到的血糖仪信号低，同时可观察到血糖试纸背面的比色窗口颜色未发生明显变化。需要注意的是，在到达20 min时立即将测试溶液置于100 ℃水浴锅中灭活。采集在加入目标物有机磷农药前后血糖仪信号的变化数据用于定量分析。

2 结果与讨论

2.1 反应时间的影响

考察探针与目标物甲基对硫磷的特异性结合时间（0～1.5 h）对血糖仪信号减弱值[ΔS]的影响。当反应1 h之后体系的[ΔS]趋于稳定，故本实验选取反应时间为1 h，结果如图1所示。

2.2 反应温度的影响

考察酶催化反应温度（25～60 ℃）对血糖仪信号增强值[ΔS]的影响。如图2所示，当酶催化反应温度低于45 ℃时，酶催化效果随温度上升而增强，并在45 ℃时达到最佳酶催化效果;在超过45 ℃后，酶催化效果大幅下降，说明高温可能会使酶部分失活，不利于酶催化反应的进行。因此，本实验选择反应温度为45 ℃。

2.3 探针浓度的影响

考察0～6.0 μmol/L探针的反应浓度对血糖仪信号增强值[ΔS]的影响。如图3所示，选择探针浓度分别为1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、3.0 μmol/L、4.0 μmol/L、5.0 μmol/L和6.0 μmol/L。

2.4 校准曲线

在选定实验条件下，在1～316 nmol/L的范围内，血糖仪信号减弱值[ΔS]与目标物浓度的对数值呈良好的线性关系，回归方程为[ΔS=3.894  5lgC+8.614 2]，相关系数为0.998 8，检出限可达1 nmol/L（图4），低于很多文献报道的方法。选择目标物甲基对硫磷浓度为100 nmol/L时，重复制备5组传感器进行平行实验得到的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为4.8%，表明该传感器具有良好的重现性。

3 结语

有机磷农药甲基对硫磷作为广谱杀虫剂引起了广泛的关注与研究。本实验构建了一种基于血糖仪的便携式传感器，利用磁珠构建信号放大系统，实现对低浓度有机磷农药甲基对硫磷的快速检测，为农药残留的快速筛查与检测提供了一种新方法。

参考文献：

[1]WEN L，MING S，LI M.A survey of determination for organophosphorus pesticide residue in agricultural products[J].Advance Journal of Food Science & Technology，2013（4）：381-386.

[2]祝本琼，陈浩，李胜清，等.溶剂去乳化分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定水样中甲基对硫磷[J].華中农业大学学报，2013（1）：63-67.

[3]付菊，谭小红，宋新建，等.石墨烯/僳嘧啶复合膜修饰电极用于甲基对硫磷的电化学测定[J].华中师范大学学报（自然科学版），2016（4）：565-570.

[4]朱丽丽.气相色谱-质谱法同时检测水体中的微量对硫磷和甲基对硫磷[J].化学分析计量，2018（1）：95-98.

[5]CARROLL A E，MARRERO D G，DOWNS S M.The healthpia glucopack™ diabetes phone：a usability study[J].Diabetes Technology & Therapeutics，2007（2）：158-164.

[6]董益阳，李吉，于强，等.一种识别多种有机磷农药的适配体及其应用：CN201810113105.6[P].2018-02-05.

[7]WEBER P C，OHLENDORF D H，WENDOLOSKI J J，et al.Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin[J].Science，1989，243：85-88.

[8]HERMANSON G T.The chemistry of reactive groups[J].Bioconjugate Techniques，1996：137-166.

3518500338207