超声波辅助提取血橙皮渣中橙皮苷及抗氧化研究

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132000）

0 引言

血橙皮渣含有丰富的多糖、果胶、色素、维生素、橙皮苷等有效成分［1］，橙皮苷（Hesperidin），又称川陈皮素［2］，化学式为 C28H34O15，是一种天然功能性组分，在陈皮、橘皮、血橙皮中含量较高。橙皮苷属于黄酮类的一种，对人体无毒无害，还具有调节免疫力，防治疾病的功能，是成药“脉通”的主要原料之一［3］。血橙同时还能促进血液循环，温润补血，具有抗氧化性，预防心血管疾病，抗癌症等保健作用。

植物成分提取方法一般有水提醇沉法、酸浸提法、碱浸提法等［4-6］。但这些提取方法存在很多缺点和不足，在能耗、收率和纯度等方面远不及超声波辅助法。超声波辅助提取法具有效率高、耗能低、溶剂用量少等特点，已应用于多种植物有效成分提取［7-8］。李建凤［9］等在研究超声波辅助提取血橙皮渣中橙皮苷的最佳工艺得到了验证。但本文不仅采用超声波辅助提取法提取橙皮苷，还与响应面实验结合，并对其抗氧化进行研究，这种研究方法在橙皮苷研究中还未见报道，分析了超声功率、乙醇浓度、提取时间和料液比4个因素对血橙皮中的橙皮苷得率所具有的影响。本文研究旨在为橙皮苷提取寻求最佳工艺及抗氧化剂开发提供一定的理论基础和依据。

1 材料与试验方法

1.1 试验材料与试剂

血橙市售、橙皮苷标准品（97%，江苏永健医药科技有限公司售），乙醇溶液，盐酸溶液，甲醇溶液，锌粉，pH试纸，水杨酸溶液，硫酸亚铁溶液，过氧化氢溶液，DPPH试剂，硝酸铝溶液（以上试剂由吉林农业科技学院理化试验室提供）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

血橙皮→晾干→粉碎过筛→加入乙醇溶剂→超声波处理→冷却过滤→调pH值→加热析晶→离心→得橙皮苷→甲醇溶解→测量计算→抗氧化分析

1.2.2 具体步骤

（1）原料预处理：血橙皮通过筛选后清洗，平整的铺放于干燥箱内，并设置干燥温度50 ℃，烘干时间6 h，待全部烘干后，用粉碎机进行多次粉碎，过40目筛，得到血橙皮粉，备用。

（2）超声波辅助提取：在分析天平上，准确称量1.000 g预处理后的血橙皮粉，放入50 mL的锥形瓶中，再在锥形瓶中按一定料液比添加乙醇溶剂。玻璃棒搅拌均匀后，按一定的比例设定不同的超声功率和超声时间进行超声提取，获得超声波辅助提取血橙皮渣中橙皮苷的最佳提取工艺条件，将粗物提冷却过滤，用盐酸溶液调节滤液pH值至4～5，在110 ℃左右的电热炉上析晶，4 500 r/min离心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到的橙皮苷粗品用75%甲醇溶液稀释，进行定性定量分析。然后将血橙皮渣中橙皮苷做抗氧化分析，初步探索其体外抗氧化性。

1.2.3 单因素试验方法

（1）料液比对橙皮苷得率的影响。准确称取处理过的血橙皮粉1 g五份，放入50 mL的锥形瓶中，在不同料液比（1：15、1：20、1：25、1：30、1：35 g/mL）的条件下进行超声提取，冷却过滤，用盐酸溶液调节滤液pH值至4～5，在110 ℃左右的电热炉上析晶，4 500 r/min离心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到的橙皮苷粗品用75%甲醇溶液稀释。在480 nm处测吸光度，计算得率。

（2）提取时间对橙皮苷得率的影响。准确称取处理过的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的锥形瓶中，不同提取时间（15、20、25、30、35 min）的条件下进行超声提取，冷却过滤，用盐酸溶液调节滤液pH值至4～5，在110 ℃左右的电热炉上析晶，4 500 r/min离心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀释，在480 nm处测吸光度，计算得率。

（3）乙醇浓度对橙皮苷得率的影响。准确称取处理过的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的锥形瓶中，不同乙醇浓度（45%、55%、65%、75%、85%）的条件下进行超声提取，冷却过滤，用盐酸溶液调节滤液pH值至4～5，在110 ℃左右的电热炉上析晶，4 500 r/min离心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀释，在480 nm处测吸光度，计算得率。

（4）超声功率对橙皮苷得率的影响。准确称取处理过的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的锥形瓶中，不同超声功率（60、70、80、90、100 W）的条件下进行超声提取，冷却过滤，用盐酸溶液调节滤液pH值至4～5，在110 ℃左右的电热炉上析晶，4 500 r/min离心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀释，在480 nm处测吸光度，计算得率。

1.2.4 响应面优化试验

响应面试验因素水平如表1。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

1.2.5 标准曲线绘制

准确称量橙皮苷标准品0.01 g，用75%甲醇溶液溶解并加入0.6 mL硝酸铝溶液，定容于10 mL容量瓶中，分别移取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 制好的标准品溶液于10 mL比色管，并定容至刻度，吸光度在480 nm处测定，对标准曲线进行绘制。

1.2.6 测定橙皮苷的含量

式中 C——橙皮苷质量浓度，mg/mL；

V——定容体积，mL；

N——稀释倍数；

M——质量，g。

1.2.7 橙皮苷的定性分析

得到的橙皮苷粗品用甲醇溶解，然后加入硝酸铝溶液，轻轻摇晃均匀，溶液变成黄色络合物，则为橙皮苷。

1.2.8 抗氧化研究

（1）自由基清除能力。取橙皮苷提取物0.100 g，然后加入70%乙醇溶液，定容至100 mL，样品待测液是将质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 配制而成，用移液管吸取5.6 mL DPPH·溶液与0.4 mL样品液，将其轻微摇晃混合均匀，并放在黑暗避光处30 min，然后用紫外分光光度计在480 nm处下测A1，为获得A0，使用70%乙醇溶液做为参比，取其三次平行试验的平均值，代入以下公式中获得清除率［10］，阳性对照为维生素C。

式中 A0——空白样吸光度；

A1——试样吸光度。

（2）羟基自由基清除能力。分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 样品待测液 1.0 mL，然后将FeSO4溶液和水杨酸-乙醇溶液各1.0 mL，分别加入样品待测液中［11］。添加蒸馏水定容至5.0 mL。再分别加入H2O2（6.0 mmol/L）溶液1.0 mL，反应10 min，在480 nm波长处测A1，为获得A0，取其三次平行试验的平均值，代入公式中，阳性对照为维生素C。

式中 A0——空白样吸光度；

A1——试样吸光度。

2 结果与分析

2.1 橙皮苷标准曲线

由图 1，得标准曲线为：Y=6.119 3X+0.025，R2=0.999 3。

图1 橙皮苷标准曲线Fig.1 Hesperidin standard graph

2.2 橙皮苷定性分析结果

溶液变成黄色络合物［12］，则为橙皮苷。

2.3 单因素试验结果与分析

考察料液比、提取时间、乙醇浓度及超声功率四个因素对橙皮苷得率的影响，结果见图2。

图2 不同因素对橙皮苷得率的影响Fig.2 Effect of different factors on extraction yield of hesperidin

由图 2可知，料液比在 1：15（g/mL）至 1：30（g/mL）时，血橙皮渣中橙皮苷的得率呈上升状态，并在1：30（g/mL）时达到最大值；溶剂的适当递增，有效成分扩散达到平衡时，残留于细胞内的浓度越小，得率升高。料液比为1：35（g/mL）时，橙皮苷的得率开始表现趋势呈下降，料液比增大反而减小了血橙渣中橙皮苷提取量的吸收，浸出随之减少。所以初步确定最优的料液比为1：30（g/mL），选择 1：25（g/mL）、1：30（g/mL）、1：35（g/mL）进行响应面试验。提取时间在15 min至20 min中，橙皮苷的得率缓慢递增，在20 min时为最大值2.91%；之后一直递减，因为长时间的超声使得是橙皮苷发生降解，同时长时间的提取也使乙醇挥发损失以及增加杂质的溶出量，还增加了能量消耗。所以初步确定最优的提取时间为 20 min，选择 15、20、25 min进行响应面试验。乙醇浓度在45%至65%时，血橙皮渣中橙皮苷的得率呈上升状态，并在65%时上升至最大值2.3%；再继续增加提取时间至85%时，含碱性乙醇溶液的增加，增加了杂质的溶解，影响了橙皮苷的溶解，从而降低了橙皮苷的得率。超声功率在60 W至80 W时，橙皮苷的得率一直在不断增加，并在80 W时上升至最大值3.0%；这是因为加大超声功率后，产生了强烈的空化效应，使超声作用更明显，搅拌粉碎作用加强，溶剂的穿透力也有所增加，提取物的溶解能力增强，得率随之变高。当超声功率达到100 W时，橙皮苷的得率慢慢下降，所以初步确定最优的超声功率为80 W，选择70、80、90 W进行响应面试验。

2.4 响应面试验

2.4.1 试验设计与结果分析

使用Design-Expert8.0软件对表3结果进行统计分析［13］，建立以下二次方程：Y=3.27-0.16A+0.11+0.086C-0.28AB-0.31AC+0.057BC-0.29A2-0.59B2-0.41B2。

对二次回归方程进行方差分析，模型的F=55.23，P＜0.0001＜0.01，说明试验采用的回归模型是高度显著水平，对于失拟项（P=0.4707＞0.05）不显著，由此说明该模型合理［14］。由表可知，A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的 P 值均小于 0.05，说明对橙皮苷得率影响显著，BCP值大于0.05，说明对橙皮苷得率影响显著较差，各因素对血橙皮渣中橙皮苷得率影响由大到小顺序为：料液比＞超声功率＞提取时间。

2.4.2 响应面及等高线分析结果

各因素交互作用对橙皮苷得率的影响如图3所示。

图3 各因素交互作用对橙皮苷得率的影响Fig.3 Effects of interactions of various factors on extraction yield of hesperidin

由图3（a）可知，三维图坡度较陡，说明料液比和超声功率的交互效应显著，在提取时间不变的情况下，超声功率增大，料液比增大，得率先增加，达到各因素的中心值，后减小，原因在于超声功率和料液比的增加，得率升高，然后根据超声波的空化效应，使其速度加快，溶剂的穿透力也有所增加，提取物的溶解能力增强，得率随之变高。

由图3（b）可知，三维图的变化明显，这说明提取时间和料液比交互效应显著，在超声功率不变的情况下，提取时间增大，料液比增大，得率先增加，达到各因素的中心值，后减小，原因在于料液比和提取时间的增加，使血橙皮粉充分浸泡，得率升高，但料液比的增加和时间的延长，使橙皮苷分解，导致得率减小。

由图3（c）可知，三维图坡度较缓，说明超声功率和提取和时间的交互效应较差，在料液比不变的情况下，提取时间延长，超声功率增大，得率先增加，达到各因素的中心值，后减小，原因在于提取时间和超声功率的增加，在超声波的空化效应下，加速橙皮苷溶出，得率不断升高，但时间过长，超声波对组织破坏，使橙皮苷降解，影响试验，导致得率降低。

由图3可知，两交互作用由大到小的顺序依次是：料液比和提取时间＞料液比和超声功率＞提取时间和超声功率。

根据上述数据进行分析和整理，最终确定条件为：料液比 1∶30（g/mL），超声功率 80 W，提取时间为20 min。并设置3次平行试验进行验证，测得得率为3.35%，与模型预测值差异较小，结果具有可靠性。

2.5 抗氧化结果

2.5.1 DPPH·清除力

由图4可知，DPPH·的清除率表现出不断增强的变化，在浓度较低时，橙皮苷和维生素C对DPPH·的清除力差异不明显，在试验范围内，橙皮苷的清除率虽然整体比维生素C低，但当橙皮苷浓度达到0.6（mg/mL）时，清除率最大达到55.80%。

图4 橙皮苷对DPPH·的清除作用Fig.4 Inhibitory effects of hesperidin on DPPH·

2.5.2 羟基清除力

由图5可知，·OH的清除率表现出不断增强的变化，而维生素C的曲线趋势变化则更为明显。维生素C清除·OH的能力明显强于橙皮苷，但橙皮苷也表现出具有一定清除·OH的能力。当浓度达到0.6（mg/mL）时，清除率最大值为64.02%。

图5 橙皮苷对·OH的清除作用Fig.5 Inhibitory effects of hesperidin on·OH

3 结语

通过单因素试验，响应面试验对血橙皮渣中橙皮苷的提取进行了研究。最终得出提取橙皮苷的适宜条件为：料液比1：30（g/mL），提取时间20 min，超声功率80 W，在此条件下试验测得的血橙皮渣中橙皮苷的得率为3.35%，与理论值相差较小，因此采用修改后的工艺条件得到的血橙皮渣中橙皮苷的得率的数值也是准确可靠的。

朱玉昌等［15］用ABTS和DPPH法评价了7个甜橙品种的抗氧化能力，发现血橙的总抗氧化能力最强。本研究发现，经过对于血橙渣中的橙皮苷的抗氧化研究，清除率与橙皮苷浓度均呈现一定的量效关系，当浓度为0.6（mg/mL）时，对 DPPH·清除率为 55.80%，对·OH 的清除率为64.02%，表明橙皮苷抗氧化性较强。由于纯化等未在实验中进行，在今后的研究中会进一步后续纯化及结构与抗氧化性的关系等相关性研究。本文为提升血橙营养保健和经济价值提供了部分依据和参考。