映山红花瓣花色苷成分组成分析

贺叶风, 张春英, 刘群录,*

(1.上海交通大学设计学院, 上海 200240; 2.上海植物园, 上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心, 上海 200231)

映山红(Rhododendronsimsii)是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(RhododendronL.)的常绿或半常绿灌木[1]，广泛分布于我国长江以南地区及台湾地区的丘陵或山地，花色鲜艳且开花繁茂，是很多杜鹃花品种的杂交亲本[1]。花色是植物最重要的观赏指标，花瓣细胞中色素种类与含量是决定花朵最终呈色的一个重要因素[2]。目前关于杜鹃花科花色素的研究报道较少，涉及的物种也少[3]。Hang等[4]研究了来自越南和日本的映山红(R.simsii)花瓣，检测到了14种花色苷，但是只鉴定了其中2种花色苷，即矢车菊素 3-O-阿拉伯糖苷和矢车菊素 3-O-半乳糖苷；Liu等[5]研究了柳条杜鹃(R.virgatum)、猴斑杜鹃(R.faucium)、硬毛杜鹃(R.hirtipes)等10种杜鹃花属植物花瓣的类黄酮，得到了5种花色苷和23种黄酮。近年来，杜鹃花花色苷研究报道有增加的趋势，但仍有许多具有重要育种价值的杜鹃属植物花色及花色素组成尚不清楚。本研究以中国原产映山红的7个不同花色株系为材料，研究了其花色素组成以及与花色的关系，以期为杜鹃花花色改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自于大别山播种苗单株经扩繁形成的株系，代号分别为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7，种植于上海植物园苗圃。映山红花瓣于2019年4—5月采集，于晴天上午9—11时，取花瓣，液氮冷冻，置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2 花色描述与测定

取盛花期的映山红花瓣，利用第五版英国皇家园艺学会比色卡(Royal Horticultural Society color chart，RHSCC)对其花色进行描述。重复5次，取频率出现最高的结果。目测和 RHSCC比色光源为非直射的日光光源(通常选择北面射入的日光)。

花色测定按照张宝智等[6]方法，采用国际照明委员会(International Commission on Illumination, CIE)表色系统表征映山红花瓣的花色。CIE表色系统的明度L*值、色相a*值、色相b*值在三维色度坐标系上，L*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面。L*值从0到100表示明度逐渐增加；红绿属性a*值由负值变化到正值，表示绿色减退、红色增强；黄蓝属性b*值由小变大，表示蓝色的减退、黄色的增强。

彩度C*和色相角h*分别根据以下公式计算。

h*=arctan(b*/a*)

式中，C*值表示到L*轴的垂直距离，距离越大，彩度越大。

1.3 花色苷总量的测定

花色苷总量(total anthocyanin，TA)测定采用pH示差法[7]。花瓣在液氮中研磨成粉，称取0.5 g样品，加入5 mL的0.1%盐酸甲醇提取液，10 000 r·min-1离心10 min后，取上清液待测。分别取1 mL提取液用pH 1.0和4.5缓冲液稀释定容至3 mL。达平衡80 min后，分别测定520 nm的吸光度。用700 nm的吸光度作为模糊度的校正，以蒸馏水做参比液，以矢车菊素3-O-葡萄糖苷作为花色苷标准品。花色苷总量用以下公式计算。

TA(mg·g-1) =AB/eL×MW×D×V/G×1 000

AB= (A520-A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5

式中，TA表示花色苷总量；AB表示两个pH下吸光度的差值；Mw表示花色苷分子量(以矢车菊3-O-葡萄糖苷计，449.2 g·mol-1)；D为稀释倍数；e为摩尔消光系数(以矢车菊3-O-葡萄糖苷计，29 600 L·mol-1·cm-1)；L为光程(1 cm)；G为花瓣鲜重(g)。

1.4 花色苷组分的定性分析

采用Acquity I-class超高效液相色谱和VION离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)对花瓣中花色苷进行定性分析。超高效液相色谱条件为：色谱柱为WATERS ACQUITY UPLC BEH C18反相硅胶柱 (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)。流动相：A为0.1%甲酸水；B为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度为0 min，5% B；3 min，20% B；10 min，100% B；12 min，100% B；15 min，95% B；19 min，95% B。流速：0.4 mL·min-1；进样量1 μL；柱温45 ℃；检测波长520 nm。

质谱条件：正离子扫描 (ESI+，质荷比50～1 000)，毛细管电压2.0 kV；锥孔电压 40 V；锥孔气流量50 L·h-1；雾化气流量900 L·h-1；离子源温度115 ℃；雾化气温度450 ℃。利用Mass Lyn×v4.1软件分析质谱结果。

1.5 花色苷组分的定量分析

分别以矢车菊素3-O-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-glucoside)、飞燕草素3-O-葡萄糖苷(delphinidin 3-O-glucoside)、锦葵素3-O-葡萄糖苷(malvidin 3-O-glucoside)、芍药花素3-O-葡萄糖苷(peonidin 3-O-glucoside)、牵牛花素3-O-葡萄糖苷(petunidin 3-O-glucoside)为标准品，通过标准曲线进行定量分析[8]，表示为每克花瓣重量对应苷元的毫克数。校准曲线如下。

矢车菊素类糖苷响应值(mAU)= 38 562×[Cy(mg·mL-1)]+15 766，R2=0.996 7

飞燕草素类糖苷响应值(mAU)= 21 920×[Dp(mg·mL-1)]-1 090.9，R2= 0.999 3

锦葵素类糖苷响应值(mAU)=46 634×[Mv(mg·mL-1)]-10 094，R2= 0.999 6

芍药花素类糖苷响应值(mAU)= 58 894×[Pe(mg·mL-1)]+8 123.1，R2= 0.997 9

牵牛花素类糖苷响应值(mAU)= 58 072×[Pt(mg·mL-1)]-4 332.3，R2= 0.999 7

1.6 统计分析

使用Microsoft Office Excel 2013进行数据整理、分析及作图，利用SPSS statistics 24软件进行方差及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 花色描述与测定结果

表1显示，根据RHSCC比色结果，Y1、Y3、Y4三个株系的花瓣颜色属于红色系(red group)，Y2、Y6、Y7三个株系属于紫红色系(red-purple group)，Y5属于紫色系(purple group)。7个映山红花色在CIE表色系统坐标系上分布广泛，亮度L*值介于47.94～68.38之间，红绿属性a*值的范围介于29.25～49.84之间，黄蓝属性b*值介于-14.44～29.44之间，彩度C*值的范围为29.25～55.56之间，色相角h*值的范围为-89.36°～88.62°之间。由红绿属性a*、黄蓝属性b*值可以得知，映山红是一个包含红色系、紫红色系在内的，色度在紫色到红色区间内变化的颜色群体。

表1 7个映山红株系花色的描述与测定值Table 1 Description and determination of petal coloration of 7 lines R. simsii

2.2 花色苷总量的测定结果

采用pH示差法测定各株系花瓣的花色苷总量，结果见图1。从图1可知，红色系的Y1、Y3、Y4的花色苷总量相对较高。其中，Y4花色苷总量最高，达到了207.1 mg·g-1FW，是Y5的10倍左右。紫红色系的Y2花色苷总量最少，仅为23.2 mg·g-1FW，辅助色素可能参与了其花瓣的显色[9]。

图1 7个映山红株系花瓣花色苷总量Fig.1 Total anthocyanins content in petals of 7 lines of R. simsii

2.3 花色苷组分的定性分析结果

表2显示，利用Acquity I-class超高效液相色谱和VION离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪在7个映山红株系花瓣中共检测出5种苷元，13种花色苷。通过对各个组分质谱分子离子和特征离子分析，结合标准样品，测定出5种苷元，分别为：矢车菊素(cyanindin，简称Cy)、飞燕草素(delphindin，简称Dp)、锦葵素(malvidin，简称Mv)、芍药花素(peonidin，简称Pe)、牵牛花素(petunidin，简称Pt)。确定了其中11种花色苷分别为：矢车菊素3-O-葡萄糖苷、飞燕草素3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷、锦葵素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-阿拉伯糖苷、芍药花素3-O-葡萄糖苷、芍药花素3-O-阿拉伯糖苷、锦葵素3-O-阿拉伯糖苷、牵牛花素3-O-葡萄糖苷、牵牛花素3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素3-O-葡萄糖苷[8,10-15]。其中第12、13两种物质是未能直接确定的花色苷。其中12号物质的二级质谱碎片质荷比为303.049 4与Dp一致，质荷比为465.102 5的碎片离子为Dp加1个六碳糖而成，结合光谱数据推定其为飞燕草素六碳糖苷。第13号物质的二级质谱碎片质荷比为301.070 1与Pe一致，质荷比为463.123 7的碎片离子为Pe加1个六碳糖而成，结合光谱数据推定其为芍药花素六碳糖苷。这两种花色苷的具体结构仍需进一步鉴定[16]。

2.4 花色苷组分的定量分析结果

从表3可以看出，除了株系Y2外，其他各株系中都含有矢车菊素类糖苷。在红色系的3个株系Y1、Y3、Y4中，以Cy糖苷和Pe类糖苷为主，Y1、Y4 Cy类糖苷比例分别占96%、97%；Y3 Cy类糖苷比例为44%，Pe类糖苷比例为30%。在紫红色系的3个株系中，以Dp类糖苷和Mv类糖苷为主，Y2 Dp类糖苷为41%、Mv类糖苷55%；Y6、Y7 Cy类糖苷分别为25%、26%，Dp类糖苷分别为52%、64%；除此之外，Y6、Y7还含Pt类糖苷比例分别为23%、10%。紫色系的Y5除了含有Cy类糖苷(15%)与Pe类糖苷(4%)，还含有Dp类糖苷(40%)、Pt类糖苷(38%)、Mv类糖苷(3%)。根据表3中结果可知，红色系株系主要以Cy类糖苷和Pe类糖苷为主，紫红系株系以Cy类糖苷、Mv类糖苷、Dp类糖苷为主，而紫色系主要为Dp类糖苷、Pt类糖苷。此外，偏紫色系的株系比红色系株系的花色苷种类更多。Mizuta等[17]在分析杜鹃花花色时也发现，紫色花瓣中的花色素苷组成(2～6种花色素)比红色花瓣(2～4种花色素)更加多样化。由于芍药花素3-O-阿拉伯糖苷、牵牛花素3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素3-O-葡萄糖苷响应值太低，表3中不计入。

表2 映山红花色苷结构的鉴定Table 2 Identification of anthocyanin structure of R. simsii

表3 映山红花色苷组分的组成及定量分析Table 3 Composition and quantitative analysis of anthocyanin components of R.simsii

2.5 花色与花色苷的关系

表4结果显示，映山红花瓣亮度L*与花色苷量总量(TA)呈显著负相关关系(P<0.05)。红绿属性a*与TA无显著相关性关系(P>0.05)；而黄蓝属性b*值、C*和h*分别与TA呈极显著正相关关系(P<0.01)。表明花色苷量总量越高，花瓣的亮度越低，彩度越高。表5中回归分析结果也说明了这一点。在各个花色苷中，Cy类糖苷含量与L*呈显著负相关关系(P<0.05)，与TA、a*、b*、C*、h*都呈极显著正相关关系(P<0.01)。说明Cy含量越高，花瓣亮度越低；花瓣越红，彩度越高。Mv类糖苷与Pt类糖苷含量与黄蓝属性b*值和h*值均呈极显著负相关关系(P<0.01)。表明Mv、Pt含量越高，花瓣越偏蓝。从表5 中方程也可以看出，映山红花瓣的红绿属性a*、黄蓝属性b*与Cy、Pe呈正相关关系，与Dp、Pt、Mv呈负相关关系。表明Cy、Pe含量越高，花瓣越红，彩度越高；Dp、Pt、Mv含量越高，花瓣越偏蓝，彩度越低，这一点与Du等[8]的研究结论相似。

3 讨论

本研究通过分析映山红不同株系的花色苷组分发现，偏紫色系株系的花色苷组成比红色系花瓣更具多样性，并且紫色系个体的a*和b*值在CIEL*a*b*坐标中比在红色系中的a*和b*值分布更广泛。不同色系花瓣花色苷总含量差异很大，红色系花色苷总含量的平均值为104.25 mg·g-1FW，远远高于紫红色系(34.11 mg·g-1FW)和紫色系(22.2 mg·g-1FW)。说明红色花瓣中花色苷含量高，可能是花瓣存在某些转录因子上调花色素生物合成途径或关键基因[18]。

Asen等[10]在对杜鹃花色苷的研究中采用薄层色谱检测到矢车菊素苷元、芍药花素苷元、锦葵素苷元；Mizuta等[18]采用HPLC法检测到飞燕草素苷元和矮牵牛花素苷元；Liu等[5]研究了10种来自西藏的杜鹃花瓣花色苷，检测到了矢车菊素苷元及锦葵素苷元。在本研究中共检测出了5种苷元，分别为矢车菊素苷元、飞燕草素苷元、锦葵素苷元、芍药花素苷元、牵牛花素苷元；发现了13种花色苷，鉴定出了11种。其中，矢车菊素3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷、飞燕草素3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素3-O-葡萄糖苷与前人对于杜鹃属花瓣花色苷种类检测结果一致[10,16]；锦葵素3-O-阿拉伯糖苷、锦葵素3-O-葡萄糖苷、牵牛花素3-O-葡萄糖苷、芍药花素3-O-葡萄糖苷、芍药花素3-O-阿拉伯糖苷和牵牛花素3-O-阿拉伯糖苷6种花色苷为首次在杜鹃属植物花瓣中检测到，但在杜鹃花科蓝莓果实中曾有过报道[11,13-15]。

表4 映山红花色与花色苷的相关性分析Table 4 Relative correlation analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

表5 映山红花色与花色苷的回归分析Table 5 Regression analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

本研究中线性回归与相关性分析显示，映山红花瓣的亮度L*与红绿属性a*之间有极显著相关性，这与Liu等[5]的研究结果一致。并且a*与Cy类糖苷、Pe类糖苷含量呈正相关关系，说明Cy类糖苷、Pe类糖苷含量越高，花瓣颜色越红。此外，Dp类糖苷、Mv类糖苷和Dp素类糖苷含量与b*呈负相关关系，表明这3类糖苷含量越多，花瓣越呈现蓝色。这与Liu等[5]的研究结果一致。

花瓣中花色苷的种类和含量受相关基因的控制[18]。因此，研究映山红不同株系间花色苷生物合成途径中的结构基因和(或)调节基因在表达水平上的差异，可以进一步从分子水平上阐明映山红花瓣呈色机理，为相关的育种工作提供科学依据。