岩藻多糖通过SIRT1/Nrf2抑制高脂饮食诱导神经前体细胞衰老的研究

刘希鹏 张美芳 唐 雯 赵安达 孙 娟 张海峰

随着人类寿命的延长，中国正逐步进入老年社会，与年龄相关的神经退行性疾病如阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease, AD)及其他形式痴呆症的发生率正逐渐增长，给社会带来沉重的医疗和经济负担。有研究表明，高脂饮食可能是AD或者其他神经退行性疾病的危险因素[1～3]。研究发现在高脂饮食喂养小鼠的大脑组织中，甘油三酯、胆固醇和神经酰胺等脂质的含量明显增加，而这些脂质代谢紊乱被证明参与了肥胖条件下神经退行性疾病的发病[3]。

近年来，一种来源于海藻中的硫酸多糖，即岩藻多糖(fucoidan)改善高脂血症及相关代谢性疾病的作用受到越来越多的重视[4,5]。有研究显示，摄入岩藻多糖后可以显著降低高脂饮食组小鼠血清胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇的水平，并可减少血管动脉粥样斑块的形成[6,7]。岩藻多糖也被发现在AD模型小鼠中能发挥神经保护作用[8]。

神经前体细胞(neural precursor cells，NPCs)是一类可以自我更新、并具有多向分化潜能的细胞，在胚胎神经发生和成人大脑的损伤修复中起着至关重要的作用[9]。NPCs的增殖分化活性自发现以来便备受关注，有望成为治疗神经退行性疾病的种子细胞[10～12]。在HFD引起神经退行性疾病的过程中，NPCs的分裂增殖和分化活性受到明显抑制，导致NPCs衰老从而加速神经退行性相关疾病的发生、发展[13,14]。因此，抑制NPCs的衰老，可以保持神经系统的再生修复能力，降低神经退行性相关疾病的发生、发展。

本研究探索了岩藻多糖在高脂饮食诱导NPCs衰老过程中的保护作用以及相关的分子机制，以期为岩藻多糖防治神经退行性疾病发生、发展的作用提供依据。

材料与方法

1.实验材料与试剂：C17.2细胞购自中国科学院上海细胞库；抗p21、p53、SIRT1抗体购自美国Santa Cruz公司,抗LaminB、α-tublin、Nrf2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,所有二抗购自美国Sigma-Aldrich公司,活性氧检测试剂盒和衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自中国Beyotime公司,SIRT1抑制剂烟酰胺(NAM)、Nrf2抑制剂葫芦巴碱(trigonelline)购自美国MedChem Express公司,DMEM培养基购自美国 Gibco公司，胎牛血清购自美国FBS公司。其他实验所需的试剂均购自美国Sigma-Aldrich 公司。

2.C17.2细胞的培养：C17.2细胞在DMEM中培养，辅以10%(v/v)胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺, 100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。在每次实验前制备PA-白蛋白复合物，将棕榈酸(palmitic acid，PA)在70℃条件下溶于100%乙醇中，再与无脂肪和低内毒素的牛血清白蛋白以10∶1(PA∶白蛋白)的比例，在50℃条件下的无血清DMEM培养基中混合6h，PA的最终浓度为100μmol/L，乙醇溶液的最终浓度小于0.5%。岩藻多糖溶解于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，用0.45μm孔滤器灭菌，并在4℃条件下储存。实验分为对照组、PA组、PA+岩藻多糖(10μg/ml)组、PA+岩藻多糖+NAM组、PA+岩藻多糖+Trigonelline组，每次实验细胞刺激时间为72h。

3.衰老相关β-半乳糖苷酶活性的测量：将刺激后的C17.2细胞按照说明书方法进行处理。C17.2细胞置于24孔板内进行培养，利用试剂盒附带的清洗缓冲液进行冲洗，再用固定缓冲液固定细胞5min;利用β-半乳糖苷酶染色液染色16h。将处理完成的C17.2细胞利用倒置显微镜观察细胞衰老情况，细胞被染成蓝色说明细胞发生衰老。相差显微镜下计数阳性细胞数目，染色阳性细胞数占500个细胞数比值表示衰老情况。

4.细胞内ROS水平的测定：使用活性氧检测试剂盒测量C17.2细胞内的ROS水平。10μmol/L Rosup刺激C17.2细胞30min作为阳性对照。将C17.2细胞置于24孔板进行培养。细胞受刺激后，利用不含血清的DMEM晃动洗涤24孔板内的贴壁细胞3次，然后与荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素(dichlorodihydrofluorescein,DCFH)在37℃、黑暗环境下孵育20min；DCHF可通过细胞膜，被细胞内ROS氧化为高荧光强度的2′,7′-二氯荧光素(dichlorofluorescein,DCF)，可在荧光显微镜下进行观察。利用Hoechst-33258进行细胞核染色，并利用流式细胞仪在488nm激发波长下测定DCF的荧光强度，以定量细胞内的ROS水平。

5.核质分离：将C17.2细胞置于100mm细胞培养皿中培养，PA和岩藻多糖刺激后，用4℃PBS洗涤，悬浮于100μl的低渗缓冲液中[10mmol/L HEPES(pH7.9)、10mmol/L KCl、0.1mmol/L EDTA, 0.1mmol/L EGTA, 10% NP-40, 1mmol/L二硫代苏糖醇, 1mmol/L甲基苯基甲基磺酰L氟化物和蛋白酶抑制剂]。将细胞在冰上孵育10min使其溶胀，细胞悬液利用涡旋机搅拌10s。然后在14000×g离心2min(4℃)。得到的上清液为细胞质提取物，沉淀物为细胞核。将上清液移至新的EP管，沉淀物在50μl高渗裂解液[20mmol/L HEPES(pH 7.9)、400mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L二硫代苏糖醇、0.5mmol/L甲基苯基甲基磺酰基氟和蛋白酶抑制剂]中再悬浮，并在冰上孵育1h，期间在漩涡机上间歇性搅拌。最后，将混合物以14000×g离心10min，得到的上清液为细胞核部分。

6.蛋白的相对表达强度测定：将细胞用4℃ PBS洗涤2次，然后在4℃ RiPA裂解缓冲液中裂解30min。将该溶液在4℃、12000×g下离心20min，从上清液中提取总蛋白。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质(每样品20μg)，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%无脂牛奶封闭，并在4℃孵育一抗。在用Tris 缓冲盐溶液洗涤4次后，在室温下将膜与结合辣根过氧化物酶的二级抗体孵育2h。利用增强化学发光体系进行检测，利用Image J软件测定蛋白的相对表达强度。

结 果

1.对HFD诱导的NPCs衰老的抑制作用：C17.2细胞衰老特征性染色(β-Gal染色)水平，PA组明显高于对照组，PA+岩藻多糖组较PA组明显降低(图1A)。细胞衰老相关蛋白p53和p21的表达水平，PA组明显高于对照组，PA+岩藻多糖组明显低于PA组(图1B)。

图1 岩藻多糖对C17.2细胞β-gal染色及p21、p53蛋白表达的影响

2.对NPCs内ROS水平的影响：与对照组比较，PA组C17.2细胞内ROS水平明显增加，PA+岩藻多糖组则显著降低PA刺激升高的ROS水平(图2)。

图2 岩藻多糖对C17.2细胞内ROS水平的影响(×200)

3.SIRT1蛋白表达结果：Western blot法分析显示，PA组SIRT1蛋白表达明显低于对照组，而PA+岩藻多糖组可显著逆转SIRT1的表达降低(图3A)。为了验证SIRT1是否在岩藻多糖抑制C17.2细胞衰老过程中发挥作用，笔者利用一种SIRT1的特异性抑制剂烟酰胺(nicotinamide, NAM)抑制C17.2细胞内SIRT1的活性。PA+岩藻多糖+NAM组比PA+岩藻多糖组抗高脂饮食诱导C17.2细胞衰老的作用明显减弱，表现为衰老细胞的百分比和p53、p21蛋白的表达水平明显高于PA+岩藻多糖组(图3B、C)。此外，笔者还发现抑制SIRT1之后，C17.2细胞内的ROS水平明显增加(图3D)。

图3 SIRT1在岩藻多糖抑制C17.2细胞衰老过程中的作用

4.Nrf2和Nqo1的蛋白表达结果：Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键调控因子，可以调节下游抗氧化酶的表达。刺激后Nrf2和Nqo1的蛋白表达明显上升，并且Nrf2的入核水平也显著增加(图4A、B)。当加入SIRT1的抑制剂NAM后，Nrf2的入核水平显著降低，Nqo1的表达显著降低(图4B)。利用Nrf2的特异性抑制剂葫芦巴碱(trigonelline)刺激C17.2细胞后岩藻多糖抑制C17.2细胞衰老的作用被明显逆转(图4C)。结果表明岩藻多糖激活SIRT1抑制C17.2细胞内氧化应激可能是通过促进Nrf2的表达和入核发挥作用。

图4 Nrf2在激活SIRT1抑制C17.2细胞衰老过程中的作用

讨 论

长期高脂饮食可以引起机体代谢紊乱，引发以胰岛素抵抗为主要特征的代谢性疾病。有研究发现脂代谢紊乱还可以改变大脑皮质神经突触，影响神经细胞线粒体功能和氧化应激反应，而这些改变与神经系统认知功能下降密切相关[14]。高脂饮食除了损伤神经元细胞外，也可以影响神经干细胞的功能。神经干细胞主要位于大脑侧脑室轴的前脑室下区和齿状回的颗粒下区。正常情况下，神经干细胞可以增殖分化成为神经元细胞，并分泌神经营养因子以补充和修复受损的神经突触，维持正常的神经功能[11]。但是，神经干细胞很容易受到多种有害刺激的影响[15]。Park等研究发现，小鼠在喂养富含PA的高脂饮食后，大脑海马组织内神经发生功能受到明显抑制，并且引起NPCs凋亡[16]。Wang等[17]也在体外培养的NPCs实验中观察到，PA引起NPCs增殖和分化障碍。本研究结果显示，PA刺激72h可引起C17.2细胞衰老，进而影响NPCs的生理功能。

氧化应激是指细胞内ROS的产生超过其抗氧化能力时的状态。氧化应激与很多病理生理过程密切相关，是细胞衰老的一个重要诱因[18]。岩藻多糖具有很强的抗氧化活性。已有研究表明，岩藻多糖可以通过抑制细胞氧化应激，降低代谢综合征小鼠的胰岛素抵抗和炎性反应[19]。并且岩藻多糖还可以通过减少细胞氧化应激抑制海马神经细胞的凋亡[20]。本研究结果发现，岩藻多糖降低了C17.2细胞的ROS水平，从而抑制C17.2细胞的衰老。

SIRT1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，参与调控细胞多种生理过程包括调节细胞周期、DNA修复、细胞凋亡、自噬以及细胞衰老等[21]。SIRT1作为一种长寿蛋白，与细胞寿命延长和其他抗衰老作用密切相关。在哺乳动物体内，SIRT1的表达会随着年龄增加逐渐降低，而当敲除SIRT1之后会加速血管内皮细胞衰老的速度[22]。相反，当细胞过表达SIRT1之后，可以显著降低细胞氧化应激水平，促进细胞分裂增殖，抑制细胞衰老和凋亡[23]。本研究结果发现，岩藻多糖显著促进了SIRT1的表达，并且当利用SIRT1抑制剂NAM抑制SIRT1的活性后，岩藻多糖拮抗C17.2细胞衰老的作用被明显逆转。SIRT1抑制细胞衰老的作用可能与其抗氧化应激活性有关。本研究发现，高脂饮食引起C17.2细胞ROS水平明显增加。而岩藻多糖可以显著降低C17.2细胞内的ROS水平。当利用SIRT1的抑制剂NAM特异性降低SIRT1的活性后，C17.2细胞内的ROS水平明显增加，并且C17.2细胞的衰老特征性染色和衰老相关蛋白的表达也明显增加，说明岩藻多糖可能通过促进SIRT1的表达，降低C17.2细胞氧化应激水平，进而抑制C17.2细胞衰老。

本研究结果还发现，岩藻多糖在C17.2细胞内显著促进Nrf2的表达水平，并促进Nrf2进入细胞核。Nrf2是调控细胞氧化应激的重要转录因子，同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节因子。当细胞发生氧化应激时，可以引起Nrf2进入细胞核，诱导下游抗氧化酶如Nqo1等的表达，发挥抗氧化作用，以维持细胞内氧化还原的稳定性。有研究发现，SIRT1可以调节Nrf2的表达[24]。本研究利用SIRT1抑制剂烟酰胺预处理C17.2细胞后，Nrf2的表达及入核水平均明显降低。推测Nrf2在岩藻多糖激活SIRT1抑制细胞氧化应激过程中发挥重要作用。

综上所述，岩藻多糖可以显著抑制高脂饮食诱导的NPCs衰老，并且岩藻多糖抑制NPCs衰老可能是通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制细胞氧化应激来发挥作用的。